采用木质纤维素制备DHA的方法与流程

文档序号:16103392发布日期:2018-11-28 00:26阅读:来源:国知局

技术特征:

1.采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:包括以下步骤:

(1)预处理:对木质纤维素原料进行预处理,得到木质素含量不高于15%,半纤维素含量不高于20%的木质纤维素底物;

(2)糖化:按照固液重量体积比1:2-1:25将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中,将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中,在34-65℃的温度条件下进行水解反应,得到含有葡萄糖的糖液;

(3)裂殖壶菌发酵:当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-180g/L后,使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器;向生物反应器中添加培养基组分,获得发酵培养基,并高温高压灭菌;然后接入活化的裂殖壶菌种子液,在28-38℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵36-80h,至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束;或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液,使糖浓度维持在5-10g/L,在28-38℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵80-120h,获得裂殖壶菌发酵液;

(4)DHA提取:将步骤(3)得到的裂殖壶菌发酵液离心处理,将裂殖壶菌菌体细胞与发酵后培养基进行固液分离,利用有机溶剂萃取法从裂殖壶菌菌体细胞中提取得到DHA。

2.根据权利要求1所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:还包括步骤(5),具体为:将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释或经过1-3倍稀释,用于配制步骤(2)的糖化培养基。

3.根据权利要求2所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:所述纤维素酶制剂通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用,将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到;所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶;所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。

4.根据权利要求3所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:所述厌氧细菌为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌;所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。

5.根据权利要求3或4所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:所述非纤维小体蛋白具有序列表SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列;以及与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95%以上,且与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性连接;所述间接性连接为:非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行连接,所述直接性连接为:非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。

7.根据权利要求6所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接为:非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接,利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联,利用纤维小体组分所带的组装模块,使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中;

所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接为:非纤维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达,通过组装模块间的特异性的非共价相互作用,实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中;所述融合表达为:非纤维小体蛋白的编码基因插入到编码纤维小体组分蛋白的序列的N端、C端或结构域序列中间的基因组上。

8.根据权利要求7所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:步骤(2)所述的糖化培养基为:磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5;

步骤(3)所述的发酵培养基为:玉米浆5-20g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,海水晶30g/L,维生素B1 5mg/L,维生素B6 5mg/L,维生素B12 5mg/L,生物素5mg/L、pH 6.5-7.5。

9.根据权利要求7所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合;所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合;预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11%,半纤维素含量不高于12%;步骤(2)糖化步骤中的温度条件为55-60℃,水解体系中的固液重量体积比为1:3-1:10。

10.根据权利要求7所述的采用木质纤维素制备DHA的方法,其特征在于:步骤(3)中,当葡萄糖浓度为60-150g/L后,使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器;在30-35℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵48-80h,至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束,或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液,使糖浓度维持在5-10g/L,在30-35℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵100-120h;所述补氮操作具体为:流加50%(w/v)的玉米浆溶液进行补氮;步骤(4)中所述的有机溶剂萃取法具体为:采用乙醇和正己烷的混合液提取DHA。

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