本发明属于苹果酒酿造技术领域，具体涉及一种低醇起泡苹果酒的制备方法及低醇起泡苹果酒。
背景技术
生产低醇及无醇苹果酒的方法主要有三类，分别聚焦于生产过程的三个阶段，即发酵前、发酵中间及发酵后。发酵前处理主要通过降低基质中可发酵糖含量来降低成品酒精度，包括添加葡萄糖氧化酶、使用未成熟果实发酵等；发酵中间处理通过减少乙醇的生成来控制酒精度，包括使用非酿酒酵母或酵母工程菌、中止发酵等方法；发酵后处理通过物理方法将酒中乙醇脱除，主要有非膜方法例如旋转锥体柱法；膜法包括反渗透、纳滤、渗透萃取、渗透蒸发及渗透蒸馏等,这些方法获得的低醇及无醇苹果酒普遍存在口味偏淡,酒体不饱满。
起泡酒的生产方法目前主要有传统瓶内发酵法即“香槟法”、大罐发酵法和转移法。苹果酒的香气是评价苹果酒品质的重要指标，但上述方法大多都对酒的香气成分产生负面影响，导致就得香气不足。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种低醇起泡苹果酒的制备方法及低醇起泡苹果酒，克服低醇苹果酒香气不足、口感偏淡和酒体不饱满的缺点，得到一种香气浓郁、口感优良的低醇起泡苹果酒。
为此，本发明的技术方案为：
一种低醇起泡苹果酒的制备方法，所述的制备方法包括以发酵菌和苹果汁为原料进行苹果原酒的发酵制备，再将苹果原酒中的部分乙醇脱除得到低醇苹果酒，最后再利用酿酒酵母进行低醇苹果酒的二次发酵；
所述的发酵菌为酿酒酵母菌和嗜酒假丝酵母菌。
可选的，以苹果汁的体积计，发酵菌种子液的接种量为4％；接种比例为酿酒酵母菌：嗜酒假丝酵母菌＝1:3；
所述的发酵菌种子液的制备包括：将发酵菌接种于ypd培养基中28℃、120rpm摇床培养24h活化两次，将活化后的发酵菌以5％的接种量接种于苹果汁中，28℃、120rpm摇床培养；
酿酒酵母菌的摇床培养时间为18h，嗜酒假丝酵母菌的摇床培养时间为24h。
可选的，所述的苹果原酒的发酵制备中：发酵温度为18℃，发酵时间为7d，苹果汁的可溶性固形物含量为12～14°brix，苹果汁的ph为3.9左右。
可选的，所述的苹果原酒中的乙醇脱除采用低温真空蒸馏方法。
可选的，所述的低温真空蒸馏方法的真空度为0.08～0.09mpa，蒸馏温度为35℃，蒸馏时间为5min。
可选的，还对低醇苹果酒进行补水、补糖并补充偏重亚硫酸钾后再进行二次发酵，水的补充量为脱除乙醇后低醇苹果酒的体积减少量，糖的补充量为保证脱除乙醇后的低醇苹果酒中的糖含量为25～30g/l，偏重亚硫酸钾的补充量为90mg/l。
可选的，所述的二次发酵的温度为15℃，碳酸氢钾添加量为1g/l，发酵时间为18d。
可选的，以脱除乙醇的低醇苹果酒的体积计，二次发酵中的酿酒酵母菌的种子液接种量为6％；
二次发酵中的酿酒酵母的种子液的制备方法包括：酿酒酵母由甘油管用ypd培养基活化两代后，以5％接种量接入灭菌后的苹果汁，28℃下120rpm培养24h；得到的菌液以8％接种量接入灭菌后的脱醇苹果酒中，28℃下120rpm培养36h后即得。
一种低醇起泡苹果酒，所述的低醇起泡苹果酒采用所述的制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的优点为：
该方法通过生物方法与物理方法结合的途径，在有效降低苹果酒酒精度的同时，保留了大部分香气物质，且二次发酵不仅给酒体带来了丰富细腻的气泡以及爽口感，更生成一部分新的香气，丰富了低醇苹果酒的香气体系，感官指标良好，色泽金黄，澄清透明，酒体醇厚协调，口感柔和。
附图说明
图1为不同发酵方式对苹果酒酒精度的影响；
图2为不同发酵温度对苹果酒的影响；
图3为不同接种比例对苹果酒酒精度的影响；
图4为不同接种量对苹果酒酒精度的影响；
图5为不同装液量对苹果酒酒精度的影响；
图6为发酵温度和接种量对苹果酒酒精度的影响；
图7为接种比例和接种量对苹果酒酒精度的影响；
图8为蒸馏温度对苹果酒乙醇含量的影响；
图9为蒸馏时间对苹果酒乙醇含量的影响；
图10为低醇苹果酒(a)、脱醇后苹果酒(b)及低醇起泡苹果酒(c)gc-ms总离子流图；
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。
具体实施方式
本发明以鲜榨苹果汁为原料，将酿酒酵母和嗜酒假丝酵母同时接入鲜榨苹果清汁中进行苹果原酒的发酵，再对得到的苹果原酒进行低温真空蒸馏脱除乙醇得到低醇苹果酒；以脱醇后的低醇苹果酒为基酒，调整糖分后接种酿酒酵母进行二次发酵即得。测定并分析蒸馏脱醇前后及二次发酵后的理化指标、香气成分。
嗜酒假丝酵母可利用酿酒酵母生成的乙醇而不发酵糖，采用酿酒酵母与嗜酒假丝酵母混合发酵的方式可降低苹果酒的酒精度，同时丰富苹果酒的香气体系；在真空条件下，乙醇沸点降低，因此可在较低的蒸馏温度下将苹果酒中的乙醇脱除，而苹果酒发酵产生的发酵物质全部保留，得到低醇苹果酒；利用脱醇得到的低醇苹果酒进行瓶内二次发酵生成新的果酒香气及二氧化碳气体，生成的二氧化碳气体溶入酒中，使酒具有爽口感。
本发明中所用的酿酒酵母选用wls21酿酒酵母菌种(文献“王林松.苹果酒专用酵母的构建及发酵动力学研究[d].西北农林科技大学，2007”中公开的21#菌株)、sj03嗜酒假丝酵母菌种(文献“宋靓靓,袁亚宏,刘斌,王虎玄,岑涛.2015.乙醇利用菌株的分离鉴定及在低醇苹果酒中的应用.现代食品科技,(6):254-258.”中公开的sj03菌株)及wf41酿酒酵母菌种(文献“王丽威.原生质体融合构建增香型猕猴桃酒酵母的研究[d].西北农林科技大学,2004.”中公开的41#菌株)。
本发明的研究过程如下：以下如无特殊说明，百分含量均为质量百分含量。
一、苹果清汁的制备
挑选充分成熟、无腐烂变质的红富士苹果，清洗、去核并切块后置于含0.05％vc和1.5％柠檬酸中静置护色20min，取出榨汁。弃去残渣，向果汁中添加70mg/l的偏重亚硫酸钾、静置15min，将果汁按照450mg/l的比例加入果胶酶，45℃水浴2h，真空抽滤得到苹果清汁，在-20℃下保存备用。
二、酵母种子液制备
将保藏于甘油管中的两株酵母菌(wls21酿酒酵母菌种和sj03嗜酒假丝酵母菌种)分别于ypd培养基(1％酵母浸粉，2％葡萄糖，2％蛋白胨)中活化(温度28℃，摇床转速120r/min，时间24h)两代后，以5％接种量分别接种于苹果汁(105℃灭菌15min)中，温度28℃，摇床转速120r/min，wls21酿酒酵母菌培养18h，sj03嗜酒假丝酵母菌培养24h，分别得到生长旺盛的wls21酿酒酵母菌种子液和sj03嗜酒假丝酵母菌种子液。
三、低醇苹果酒混菌发酵工艺优化
(1)发酵方式的选择
将制备好的wls21酿酒酵母菌种子液和sj03嗜酒假丝酵母菌种子液以8％接种量分别接种于灭菌后的苹果汁中，21℃静置发酵，每天测定发酵液的可溶性固形物含量，至可溶性固形物含量不再明显降低时停止发酵，6000r/min离心10min去除菌体，得到的低醇苹果酒用于酒精度测定。
发酵方式：
①wls21与sj03单菌发酵；
②wls21与sj03同时接种混合发酵；
③先接种wls21，2d、3d后接种sj03混合发酵；
④先接种sj03，2d、3d后接种wls21混合发酵。
选取酒精度最低的发酵方式进行后续试验。结果如图1所示。
由图1可以得出，在嗜酒假丝酵母sj03单菌发酵时，苹果酒的酒精度为0.2％vol，基本接近于0，即可认为sj03单菌发酵时几乎不生成乙醇。在酿酒酵母wls21单菌发酵时，苹果酒的酒精度为6.1％vol，显著高于二者混合发酵时苹果酒的酒精度，即采用酿酒酵母wls21和嗜酒假丝酵母sj03混合发酵的发酵方式在降低苹果酒的酒精度方面有明显作用。在菌株接种顺序方面，酿酒酵母wls21和嗜酒假丝酵母sj03同时接种时，苹果酒的酒精度最低；此外，先接种sj03时，比先接种wls21的情况下苹果酒的酒精度低；在接种时间间隔方面，两株菌相隔2d或3d接种，苹果酒的酒精度无显著差异。因此，选择酿酒酵母wls21与嗜酒假丝酵母sj03同时接种，可得到酒精度最低的苹果酒，后续试验采用此接种方式。
(2)混菌发酵工艺条件单因素试验
①发酵温度对酒精度的影响
灭菌后的苹果汁可溶性固形物含量为13°brix，ph为3.94，以8％接种量、接种比例wls21：sj03＝1：1，装液量150ml，发酵温度分别为15℃、18℃、21℃、24℃、27℃静置发酵。每天对发酵液带瓶称重，当其质量变化低于0.2g/d时认为发酵结束，7000g离心10min去除菌体，测定苹果酒酒精度。平行2次。结果如图2所示。
由图2可以得出，随着发酵温度的升高，酒精度呈现出先降低后升高的趋势。在温度为24℃时，苹果酒酒精度最低，为5.6％vol；在温度为27℃时，苹果酒酒精度最高，为6.6％vol。这可能是由于在15℃-24℃范围内，随着温度的升高，嗜酒假丝酵母sj03代谢乙醇的活力逐渐增强，其降解乙醇的效率提高，使得酒精度随温度升高而降低；而当发酵温度达到27℃时，其代谢活力受到抑制，乙醇降解能力下降，发酵过程中生成的酒精不能被及时降解，因此酒精度反而升高。综上，选择18℃、21℃和24℃这三个水平进行响应面优化试验。
②接种比例对酒精度的影响
灭菌后的苹果汁可溶性固形物含量为13°brix，ph为3.94，以8％接种量，装液量150ml，接种比例sj03：wls21分别为0.5:1、1:1、2:1、3:1，21℃静置发酵。每天对发酵液带瓶称重，当其质量变化低于0.2g/d时认为发酵结束，7000g离心10min去除菌体，测定苹果酒酒精度，平行2次。结果如图3所示。
由图3可以得出，随着发酵比例的降低，即嗜酒假丝酵母sj03的接种比例增大，苹果酒的酒精度呈现出逐渐下降的趋势。这说明在接种量相同的情况下，增大嗜酒假丝酵母sj03的相对比例，可以有效降解发酵过程中生成的乙醇，从而达到降低苹果酒酒精度的作用；且嗜酒假丝酵母sj03的相对比例越大，对苹果酒的降醇效果越显著。综上，选择wls21：sj03＝1：1、1：2和1：3这3个水平进行响应面优化试验。
③接种量对酒精度的影响
灭菌后的苹果汁可溶性固形物含量为13°brix，ph为3.94，以接种比例sj03：wls21＝1：1，装液量150ml，接种量分别为4％、6％、8％、10％接种，21℃静置发酵。每天对发酵液带瓶称重，当其质量变化低于0.2g/d时认为发酵结束，7000g离心10min去除菌体，测定苹果酒酒精度，平行2次。结果如图4所示。
由图4可以得出，接种量为4％时，酒精度最低，为5.2％vol；接种量为10％时，酒精度最高，为6.6％vol，且随着接种量的增大，苹果酒的酒精度逐渐升高，这可能是由于当接种比例一定时，随着接种量的增大，酿酒酵母wls21的绝对生物量增大，虽然嗜酒假丝酵母sj03的绝对生物量也在增大，但是wls21的活力比sj03强，因此wls21可能对sj03产生一定的抑制作用，导致sj03无法表现出足够的降醇能力，即使增大接种量，也不能有效降低苹果酒的酒精度。综上，接种量选择4％、6％和8％这三个水平进行响应面优化试验。
④装液量对酒精度的影响
灭菌后的苹果汁可溶性固形物含量为13°brix，ph为3.94，以8％接种量、接种比例wls21：sj03＝1：1，250ml锥形瓶装液量分别为100、150和200ml，21℃静置发酵。每天对发酵液带瓶称重，当其质量变化低于0.2g/d时认为发酵结束，7000g离心10min去除菌体，测定苹果酒酒精度，平行2次。结果如图5所示。
由图5可以得出，250ml锥形瓶装液量分别为100、150和200ml时，苹果酒的酒精度分别为5.5％vol、5.7％vol和5.8％vol。酒精度最高值与最低值差别仅为0.3％vol，说明该因素对苹果酒酒精度影响不大，因此直接选定装液量为150ml。
(3)混菌发酵工艺条件响应面优化
①根据单因素试验的结果及box-behnken设计原理，利用试验设计软件优化酿酒酵母与非酿酒酵母混菌发酵酿造低醇苹果酒的工艺，以酒精度为响应值，对影响发酵工艺的因素进行3因素3水平中心组合设计，对结果进行响应面分析，响应面设计因素水平编码表见表1。
表1因素水平编码表
根据bbd响应面设计原理，采用三因素中心组合设计来选择设计点，并且每个因素被指定为3个水平以优化发酵参数。为了解发酵工艺参数对低醇苹果酒品质的影响，采用多元线性回归法拟合试验数据，生成二阶响应面回归方程。box-behnken试验设计方案及试验结果如表2，回归模型方差分析表如表3。
表2bbd试验设计方案及结果
表3回归模型方差分析表
注：*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示极显著。
根据designexpertv8.06软件方差分析结果，初步建立了低醇苹果酒酒精度与发酵温度、接种比例及接种量三个因素之间的回归方程如下：
y＝4.68+0.19x1+0.038x2+0.075x3+0.15x1x2-0.48x1x3-0.57x2x3-0.47x12+0.24x22-0.39x32
其中x1是发酵温度的编码值，x2是接种比例的编码值，x3是接种量的编码值。由表3可知，所建的二次回归模型p值小于0.01，说明该模型显著，而失拟项p值大于0.05，失拟项不显著，说明所建的二次模型拟合程度较高，试验过程中的误差较小。在表中还可以看出，确定系数r2和调整确定系数adjr2系数分别为0.9326和0.8460。结果表明，因素对测试结果有显著影响，因素变化与测试结果之间的关系是真实可靠的。同时，低变异系数(c.v.％＝4.88)表明该模型具有较高的精度和可靠性。由表3还可以看出，在该回归模型中，ac、bc、a2、c2为极显著因素(p<0.01)，a为显著性因素(p<0.05)，b、c、ab、b2为不显著因素。
②响应面分析
响应面分析中的3d曲面图和等高线图能够直观反应因素之间的交互作用。根据designexpertv8.06得到低醇苹果酒发酵工艺的回归方程，因素发酵温度和因素接种量之间的交互作用如图6所示。
由图6可以得出，发酵温度一定时，酒精度随着接种量的逐渐增大呈现出先增大后减小的趋势；当接种量一定时，苹果酒酒精度随着发酵温度的逐渐增大也呈现出先增大后减小的趋势。
接种比例与接种量的交互作用如图7所示。由图7可以得出，当接种比例一定时，苹果酒的酒精度随着接种量的逐渐增大而呈现出先增大后减小的趋势，这是由于适宜的接种量使得嗜酒假丝酵母sj03能够形成一定的生物量优势而不被酿酒酵母wls21所抑制，从而发挥其降解乙醇，降低苹果酒酒精度的作用，接种量过高或过低，都不能达到这种效果。
③验证
软件designexpertv8.06给出的低醇苹果酒最优工艺条件是发酵温度18.56℃，接种比例wls21：sj03＝1:3，接种量4％。在此优化条件下，预测可得到酒精度为3.2％vol得苹果酒。为了便于工业化操作，验证试验在发酵温度18℃，接种比例wls21：sj03＝1:3，接种量4％的条件下实施，得到酒精度为3.3％vol的苹果酒，与模型预测值较为吻合，相比对照组酒精度6.1％vol，该工艺条件酿造的苹果酒酒精度降低了2.8％vol，酿造得到的低醇苹果酒理化指标分析如表4所示。
表4低醇苹果酒理化指标
由表4可知，低醇苹果酒酒精度为3.3％vol，符合国标规定。因此，采用该法得到的低醇苹果酒酿造工艺参数可行，在实际应用中有一定价值。
四、低温真空蒸馏工艺确定
(1)低温真空脱醇温度的选择
使用低温真空蒸馏设备，将升温至20℃的低醇苹果酒用量筒量取20ml，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下进行低温真空蒸馏脱醇试验，控制蒸馏烧瓶转速保持恒定，待整个体系真空度达到0.08mpa时开始计时，蒸馏进行5min后停止计时，取下样品，20℃水浴30min，用超纯水补足体积至20ml。每组试验重复两次。
得到的样品制取蒸馏液后用重铬酸钾氧化比色法，在600nm下测定吸光度，由标准曲线得到样品的酒精含量。结果如图8所示。
由图8可以得出，随着蒸馏温度的提高，样品中的乙醇含量呈逐渐减小的趋势。原酒中乙醇含量为18.17mg/ml，在真空条件下，25℃时已能将部分乙醇脱除；当温度达到35℃时，样品中乙醇含量仅为5.17mg/ml，乙醇脱除率为71.5％。此后即使温度再提高，乙醇脱除率的提高也不显著，考虑到真空蒸馏在脱除乙醇的同时，温度越高，香气成分的损失也越大，因此，选择35℃为蒸馏温度。
(2)低温真空脱醇时间的选择
使用低温真空蒸馏设备，将20℃的低醇苹果酒用量筒量取20ml进行低温真空蒸馏脱醇试验，蒸馏烧瓶转速保持恒定，水浴温度为35℃，待整个体系真空度达到0.08mpa时开始计时，分别处理2min、3min、4min、5min、6min，结束后取下样品，20℃水浴30min，用超纯水补足体积至20ml。每组试验重复2次。乙醇含量测定方法同上。结果如图9所示。
由图9可以得出，样品初始乙醇含量为14.66mg/ml，随着蒸馏时间的延长，样品中乙醇含量逐渐降低，且降低速率随时间减小。当蒸馏时间达到5min时，样品中乙醇含量为3.54mg/ml，乙醇脱除率达到75.9％，此后即使蒸馏时间再延长，乙醇脱除率也未显著提高，考虑到真空条件下，蒸馏时间越长，产品香气损失越大，因此，选择蒸馏时间为5min。
五、反渗透脱醇工艺确定
采用国产纳滤膜(济南荣德水处理设备有限公司)进行试验。
(1)反渗透时间的确定
测定膜在反渗透过程中从开始工作到1h时间内，每隔10min的膜通量变化，确定膜趋于稳定的时间点。
(2)浓缩系数的确定
在使用膜对原酒进行脱醇的过程中，测定膜在浓缩系数(剩余料液量/原料液量)为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9时的浸出物损失率，分别确定反渗透过程中膜补加水至原体积的工艺。浸出物损失率为单位体积透过液中浸出物含量。
(3)操作压力的确定
测定膜在压力为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mpa时的乙醇通量和浸出物通量，以及乙醇透过率和浸出物透过率，确定膜的最优操作压力。
通过对膜的工艺研究，得出该膜的最佳反渗透工艺为：反渗透时间40min，浓缩系数为0.7，膜压力为1.6mpa。
六、脱醇方式的确定
对上述低温真空蒸馏工艺和反渗透脱醇工艺较佳条件下得到的脱醇苹果酒的理化指标及香气物质含量进行测定分析，如表5和表6所示。
表5脱醇苹果酒理化指标
由表5可知，低温真空蒸馏工艺对苹果酒的可溶性固形物、总糖和总酸产生大的影响不大，而反渗透脱醇工艺则对其影响较大；两种工艺对苹果酒酒精度的影响均不明显。综合分析得出低温真空蒸馏工艺得到的低醇苹果酒酒体饱满、醇厚协调。
表6样品香气物质含量(mg/l)
由表6可得，经低温真空蒸馏后的苹果酒和反渗透脱醇后的苹果酒与原酒相比，香气物质有一定损失。原酒样品中共检测出54种香气物质，总含量为7.092mg/l。其中高级醇类物质16种，总含量为1.997mg/l；酚类物质1种，总含量为0.013mg/l；醛类物质2种，总含量为0.119mg/l；酸类物质9种，总含量为1.327mg/l；酯类物质26种，总含量为3.636mg/l。经低温真空蒸馏后的苹果酒样品中共检测出香气物质27种，总含量为3.041mg/l，比蒸馏前样品减少27种，总含量减少3.456mg/l，减少了48.7％。蒸馏后样品中，高级醇类物质8种，总含量为0.405mg/l；酚类物质1种，总含量为0.045mg/l；酸类物质7种，总含量为0.717mg/l；酯类物质11种，总含量为1.874mg/l。经反渗透脱醇后的苹果酒共检出香气物质13种，其中醇类3种，总含量为0.172mg/l；酚类1种，总含量为0.017mg/l；酸类3种，总含量为0.433mg/l；酯类6种，总含量为1.581mg/l。
综上所述，采用低温真空蒸馏对苹果酒进行脱醇，得到的苹果酒在香气方面与反渗透得到的苹果酒相比，物质种类及含量都更高。
本技术确定低温真空蒸馏工艺比反渗透脱醇工艺要好，得到的苹果酒酒体饱满、醇厚协调及香气损失更少。
七、二次发酵种子液制备
将筛选得到的二次发酵最优菌株在ypdl培养基中活化两次，每次接种量5％，28℃下120r/min培养24h；得到的菌液以5％接种量接入灭菌后的苹果汁，28℃下120r/min培养24h；得到的菌液以8％接种量接入灭菌后的经低温真空蒸馏得到的脱醇苹果酒中，28℃下120r/min培养36h，取出备用。
八、二次发酵工艺条件优化
选用酿酒酵母wf41,选取碳酸氢钾添加量(g/l)、接种量(％)、发酵时间(d)为考察因素，以感官评分值为考察指标，使用软件minitab16.0设计3因素3水平正交试验，选出最优工艺条件，如表7所示。
表7正交试验因素水平表
选用250ml棕色耐压啤酒瓶进行试验，每瓶装入200ml4.2.1中的脱醇苹果酒，为了防止杂菌污染，补加90mg/l偏重亚硫酸钾，补加糖至25g/l，然后按照表5中的试验方案进行试验，压盖密封后15℃下静置发酵。发酵结束后开瓶取样，进行感官评定。
根据预试验结果及相关文献报道，选用菌株wf41，选取碳酸氢钾添加量(g/l)、接种量(％)、发酵时间(d)为考察因素，以各处理的感官评分值为指标，使用软件minitab16.0设计三因素三水平正交试验，并进行极差分析。试验结果如表8所示。
表8二次发酵工艺正交试验表
通过极差分析得出，影响低醇起泡苹果酒感官评分的因素由大到小依次为b>a>c，即碳酸氢钾添加量>接种量>发酵时间，所以最终确定接种量6％，碳酸氢钾添加量1.0g/l，发酵时间18d。
在得到的二次发酵最优工艺条件下进行验证试验，得到的低醇起泡苹果酒感官评分值为80.4，酒体澄清，香气纯正，具备起泡酒的应有口感；酒精度为1.8％vol，co2压力(20℃)为0.45mpa。
二次发酵后苹果酒理化指标如表9所示。
表9苹果酒二次发酵前后理化指标
九、香气成分测定
①香气成分富集：采用顶空固相微萃取法(hs-spme)进行香气成分的富集。移取5ml苹果酒样品于15ml样品瓶中，加入1.5g氯化钠和一定量的内标溶液，在磁力搅拌器上，45℃平衡10min，再用老化处理过的100μmpdms萃取头插入样品瓶，顶空吸附35min。
②香气成分gc-ms检测：将吸附香气成分的pdms纤维头插入气相色谱进样口，250℃下解析5min。使用的色谱柱为db-wax弹性石英毛细管柱(30m*0.25mm*0.25μm)。分流方式为不分流，色谱柱升温程序为，起始温度40℃,保持5min，以3℃/min的升温速度升至120℃，再以8℃/min的升温速度升至230℃，保持10min，载气为he，流速为0.8ml/min。质谱条件：ei电离源，电子能量为70ev，离子源温度为200℃，扫描范围为33-450amu，灯丝流量为0.25ma，检测器电压为350v。
低醇苹果酒、脱醇后苹果酒及低醇起泡苹果酒的香气测定总离子流图如图10所示，图10中的a图为低醇苹果酒，b为脱醇后苹果酒，c为本发明制备得到的低醇起泡苹果酒，香气物质及含量如表10所示。
表10样品香气物质含量(mg/l)
通过对低醇苹果酒、脱醇后苹果酒、低醇起泡苹果酒香气物质的分析可知，二次发酵后的香气物质总量显著提高，主要体现在高级醇及酯类物质含量的提高。说明二次发酵可以有效提高脱醇后苹果酒的香气物质含量，弥补因蒸馏造成的香气损失，增加低醇起泡苹果酒的香气物质。
实施例1：
(1)苹果清汁的制备
挑选充分成熟、无腐烂变质的红富士苹果，清水清洗、去核并切块后置于含0.05％vc和1.5％柠檬酸中静置护色20min，取出榨汁。弃去残渣，向果汁中添加70mg/l的偏重亚硫酸钾、静置15min，将果汁按照450mg/l的比例加入果胶酶，45℃水浴2h，真空抽滤得到苹果清汁，在-20℃下保存备用。
(2)酵母种子液制备
将保藏于甘油管中的两株酵母菌分别于ypd培养基(1％酵母浸粉，2％葡萄糖，2％蛋白胨)中活化(温度28℃，摇床转速120r/min，时间24h)两代后，以5％接种量分别接种于苹果汁(105℃灭菌15min)中，温度28℃，摇床转速120r/min，wls21培养18h，sj03培养24h，得到生长旺盛的种子液。
(3)混菌发酵
苹果汁105℃灭菌15min，以苹果汁体积计，以4％接种量，接种比例wls21：sj03＝1:3接种酵母，18℃发酵7d，5000rpm离心10min去除菌体，得到低醇苹果酒。
(4)低温真空脱醇工艺
将(3)得到的低醇苹果酒利用旋转蒸发仪进行低温真空蒸馏脱醇，真空度为0.08～0.09mpa，蒸馏温度为35℃，蒸馏时间为5min。蒸馏完成后用纯净水补足至原体积。
(5)基酒调配
将(4)得到的低醇苹果酒补加糖至25g/l，补加偏重亚硫酸钾90mg/l，添加碳酸氢钾1g/l。
(6)酵母种子液制备
将酿酒酵母wf41由甘油管在ypdl培养基中活化两次，每次接种量5％，28℃下120r/min培养24h；得到的菌液以5％接种量接入灭菌后的苹果汁，28℃下120r/min培养24h；得到的菌液以8％接种量接入灭菌后的脱醇苹果酒(5)中，28℃下120r/min培养36h，取出备用。
(7)二次发酵工艺
调配好的基酒装入250ml耐压酒瓶，每瓶装200ml。以6％接种量接种酿酒酵母wf41种子液，压盖密封后，15℃恒温发酵18d。发酵期间每天将瓶身旋转一定角度直至接近竖直倒立状态，发酵结束后将瓶口于液氮中冷冻，开瓶吐渣，补充一定量的低醇苹果酒，压盖密封，得到成品。
该实施例得到的低醇起泡苹果酒的co2压力为0.45mpa(20℃)，酒精度为1.8％vol。共检测出香气物质37种，总含量为6.113mg/l，比发酵前提高了101.1％。其中，醇类物质检出9种，总含量为1.395mg/l，比发酵前总含量0.405mg/l提高了244.4％；酚类物质共检出4种，与发酵前1种相比增加了3种，总含量为0.035mg/l，与发酵前总含量0.045mg/l相比基本持平；醛类物质2种，总含量为0.006mg/l；酸类物质两种，总含量为0.109mg/l，与发酵前0.717mg/l相比降低了84.8％；酯类物质共检出20种，总含量为4.568mg/l，比发酵前1.874mg/l相比提高了143.8％。低醇起泡苹果酒具有较高的感官品质：呈金黄色，澄清透明，香气协调、浓郁，没有异味，具有苹果酒的典型性。