一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用的制作方法

本发明属于基因工程、免疫学和肿瘤学
技术领域：
，特别涉及一套基于crispr/cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用。
背景技术：
：从酵母菌到哺乳动物的研究中均证实自噬系统受到一些进化的自噬相关蛋白（atg）的严格调控。自噬始于becn1/beclin1与iii类磷脂酰肌醇3-激酶（pik3c3），它有助于吞噬泡吸收其他atg蛋白形成细胞核。在扩增时，细胞质内容物被双膜吞噬泡直接吸收，然后生成完整的自噬体；自噬体与溶酶体融合降解其它物质。自噬体成熟需要一系列的泛素样共轭事件，主要涉及lc3-磷脂酰乙醇胺（pe）和atg12-atg5-atg16l1共轭体系。这些核心atg蛋白，包括atg16l1，都是自噬体不可或缺的。atg16l1与atg12-atg5交互共轭形成二聚体复合物，其靶向吞噬细胞并通过充当一种脂质e3类泛素连接酶促进map1lc3b/lc3b（微管相关蛋白质1轻链3b）酯化，虽然atg16l1在自噬过程中的功能过程有据可查，但对atg16l1活性的调控机制知之甚少。csnk2是一个高度保守的，组成性的，广泛表达的丝氨酸-苏氨酸激酶，是一个包含2个催化亚基的四聚体全酶（csnk2a1/a和/或csnk2a2/a'）和2个监管亚基（csnk2b/b）的复合物。该酶承担超过300个底物的磷酸化并影响一系列的生物过程，包括染色体分离，纺锤体形成，调节细胞凋亡，控制细胞增殖，和昼夜节律。最近的研究也表明appp1在自噬调控中发挥潜在的作用。蛋白磷酸化可以被磷酸酶等逆转，例如ppp1，一种普遍表达的真核丝氨酸/苏氨酸，是能影响多种细胞功能和过程的蛋白磷酸酶。ppp1归属的蛋白磷酸酶家族包括4个主要亚科：ppp1，ppp2ca，ppp2cb和ppp5。有趣的是，像csnk2一样，ppp2（蛋白磷酸酶2）促进亲自噬becn1活性通过诱导构象变化becn1在ras-nih3t3细胞中。核酸适配体是一类能与靶分子高特异性高亲和力结合的dna或rna序列，具有与抗体类似的作用，常常被称为“化学抗体”。近年来，随着核酸适配体筛选技术的不断发展，越来越多的肿瘤相关核酸适配体序列被人们所发现。然而，这些肿瘤相关的核酸适配体常常仅能识别一种肿瘤细胞或一种肿瘤，很大程度限制了核酸适配体的应用。crispr/cas9技术作为近几年的热门技术，是众多学者研究和应用的对象，crispr/cas9技术对靶细胞目的基因进行靶向敲除（knockout）或敲入（knockin）多是用于基因治疗，运用此方式构建细胞模型进行进一步生物学研究还有待开发。目前，cell-selex进行核酸适配体筛选多是针对不同种类的未知靶点的肿瘤细胞进行。但不同肿瘤细胞之间具有差异性，缺乏共同的靶标分子。因此，利用crispr/cas9技术构建稳定表达目的基因的稳转细胞系，减少细胞模型的构建时间，降低模型的构建成本，是本领域技术人员亟待解决的难题。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种分子量较小，易于合成与修饰，提出一套基于crispr/cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用。为实现本发明目的，使用的技术方案为：一套基于crispr/cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，所述的适配体为seqidno：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。优选的，所述的适配体具有与seqidno：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。优选的，所述的适配体具有与seqidno：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。优选的，所述的适配体具有与seqidno：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。优选的，所述的适配体具有与seqidno：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行优化截短的序列。优选的，所述的适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。优选的，所述的适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。优选的，所述的肿瘤标志分子核酸适配体具有与seqidno：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。本发明还提供一套基于crispr/cas9的肿瘤标志分子核酸适配体在制备肿瘤标志分子检测试剂盒或检测试剂纸的应用。本发明突出的实质性特点和显著的进步是：本发明核酸适配体利用全菌消减cell-selex技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合atg16l1、csnk2、ppp1，与其它靶标不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存，可用于检测atg16l1、csnk2、ppp1，并且有效地预防及控制atg16l1、csnk2、ppp1感染具有重要意义。利用crispr/cas9技术构建稳定表达目的基因的稳转细胞系，可以大大减少细胞模型的构建时间，降低模型的构建成本，能解决活细胞进行适配体筛选时靶标分子未知的难题，采用所述适配体制备的atg16l1、csnk2、ppp1检测试剂盒和试剂纸对atg16l1、csnk2、ppp1检测灵敏度高，且易于优化。其中，本发明仅以ppp1为例。附图说明图1是pcr退火温度优化图。3%琼脂糖凝胶电泳显示在不同温度下使用文库作为模板的pcr扩增效果，泳道1=47.2°c，泳道2=47.3°c，泳道3=47.6°c，泳道4=48.1°c，泳道5=48.8°c，泳道6=49.5°c，泳道7=50.2°c，泳道8=50.9°c，泳道9=51.6°c，泳道10=52.2°c，泳道11=52.6°c，泳道12=52.8°c.泳道m=20bpdnaladdermarker可见泳道6具有最明亮的条带，故选择泳道6温度（49.5°c）作为最优退火温度。图2是第19轮筛选产物测序比对结果图按照dna序列中高保守区域的相似性，将测序结果分为五个家族。图3是候选适配体与293t-ppp1细胞结合荧光成像结果(400x)。图4是候选适配体与293t细胞结合荧光成像结果(400x)。图5是胰酶对ppp1-4结合能力的影响随着胰酶对靶细胞293t-ppp1处理时间的延长，ppp1-4与293t-ppp1结合的荧光强度呈逐渐减弱趋势。图6是各条适配体截短序列与靶细胞结合情况流式结果。a.与原序列相比，ppp1-4a及ppp1-4b与靶细胞293t-ppp1结合荧光强度有少许减弱，而ppp1-4c能维持与原序列相似的结合能力。b.ppp1-4a、ppp1-4b及ppp1-4c均不能与阴性细胞293t结合。具体实施方式下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例：本发明的基于crispr/cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用，本实施例以ppp1为例，具体技术方案如下：1.dna文库选择在适配体筛选过程中，随着pcr的进行，筛选产物会由特异性向非特异性发生转化。因此在进行文库选择的时候，应选择自身g/c碱基比例较高的文库，以减少pcr阶段非特异性产物的生成。本发明参考kang等发表的适配体筛选相关文献所使用的文库：5’-gaattcagtcggacagcg-n45-gatggacgaatatcgtctccc-3’，该文库gc比例达到51.8%，具有较高的g/c比例，且中间含有45个随机碱基，既保证了文库的丰富性，又不因为长度过长而导致结构不稳定。2.pcr退火温度优化合适的退火温度可有效减少非特异性条带的产生，因此，需对pcr条件中退火温度进行优化。参考引物tm值及文献报道中的pcr条件，采用温度梯度pcr方法来进行退火温度优化的考察。具体步骤为将退火温度设置为47°c至53°c之间，由pcr仪自动进行温度梯度的安排设置。待pcr反应完成之后，将pcr产物进行3%琼脂糖凝胶电泳并拍摄，具体结果如图1所示。结果显示，在文献报道温度49.5°c时，pcr具有最为清晰明亮的条带，且无弥散及非特异性扩增，故选择该温度作为后续pcr退火温度，作为本次筛选中pcr的适宜退火温度。3.筛选流程利用crispr/cas9技术成功构建稳定高表达人ppp1基因的293t-ppp1细胞系。适配体筛选过程是一个多轮重复的、渐进的过程，任何一个环节出现错误都将影响到最后的结果，严重时甚至导致整个实验失败。因此，在遵照基本cell-selex筛选步骤的前提下，需要对细节的把控，以提高适配体的筛选效率。具体要如下：（1）保证细胞状态适配体筛选是否成功与细胞状态有着十分密切的关系。细胞状态较差时可能会影响其表面蛋白的正常表达，导致预期适配体靶标的缺失或改变，从而影响适配体筛选的进行。本发明选用的两组正反筛选细胞分别是293t-ppp1及293t这两种贴壁细胞。在每次筛选之前，均需保证两种细胞培养时间在24-48h之内，这是因为培养时间过短可能导致细胞贴壁尚未达到理想状态，而培养时间过长可能导致细胞贴壁过于牢固，在刮去细胞并收集的环节较为困难。此外，细胞还应处于生长最为旺盛的对数生长期，并保持活力大于90%。细胞活力的判断主要是依据台盼蓝负染方法进行，细胞活性较好时，不会被台盼蓝染色，在镜下仍然能观察到透光性良好的细胞；当镜下观察结果显示细胞被染成蓝色时，提示细胞状态较差，甚至已经死亡。（2）筛选温度的选择温度对细胞与dna的结合常常会产生一定的影响。因此，选择合适的温度对适配体筛选成功与否起着重要的决定作用。本发明所进行的筛选选择在4°c环境下进行，这是由于随着时间的延长，处于高温环境下（如37°c）细胞会对dna产生内吞，一定程度上影响了文库的丰富性，而适当的降低筛选温度即可以有效避免这一现象。（3）积极引入反筛为尽快获得具有较高特异性的适配体，应该尽量在第3轮之前加入反筛选。本发明中，将反筛选步骤加在每一轮正筛选之前，这样可以直接将不与反筛选细胞结合的dna收集并投入到正筛选细胞当中，而不需要进行其他洗涤步骤，在简化筛选步骤的同时避免了筛选文库的部分损失。（4）筛选压力的增加随着筛选轮数的增加，要逐渐增大筛选压力，才能有效提高筛选效率及成功率。筛选压力的增加主要体现在洗涤时间、洗涤次数、孵育时间等方面。具体来说，就是随着筛选轮数的增加，酌情延长反筛选细胞与dna文库的孵育时间，以使反筛选进行的更加完全，使得文库中特异性较差的dna去除的更加彻底；同时减少dna文库的用量并且将其与正筛细胞孵育时间缩短，洗涤强度增加。这种做法不仅可以提高适配体的筛选效率，还能使筛选获得的适配体具有更佳的结合能力。本文对筛选压力的调控具体明细如表1所示。表1筛选压力调控明细表筛选轮数文库用量(pmol)正筛培养皿规格(mm)正筛孵育时间(min)反筛培养皿规格(mm)反筛孵育时间(min)洗涤缓冲液体积(ml)150001060--222781060--232891055--243451055630253361050630363561050635373406456353832064564039300640640410280640104541126063510454122406351050413220630105051420063010555152006301055516200630106051720063010605182006301060519200630106054.测序结果一级结构分析筛选完成后，将第19轮筛选产物进行无标记的pcr扩增，之后送至上海生工生物工程有限公司进行ta克隆，之后随机挑选50个克隆子进行测序。公司返回有效序列50条，全部测序成功。与原始文库相较，仅有1条序列随机区域碱基数量减少1个，其余所有序列均与原始文库具有同样长度的碱基数量（84bp），且经过比对发现，所有序列均与原设计具有相同的上下游固定区域。利用clustalx2.0.3软件对这些测序结果进行一级结构比对分析。由图3-6所示，测序所得结果除上文中提到的完全重复序列外，也有部分序列之间具有较为相似的碱基，如附图2所示。按照一级结构比对分析结果，可将测序结果大致划分为五个家族。可以看出，在这些家族之中，有一些家族中核酸序列是at碱基含量较为丰富的，这些家族的核酸序列可能具有较为灵活的二级结构，而有一些家族中核酸序列则具有较为丰富的gc碱基含量，这些序列可能具有更加稳定的结构。故还需要采用流式细胞术等实验手段对这些家族序列进行进一步考察。5.候选适配体荧光显微成像将验证得到的三条受环境影响较小的候选适配体（ppp1-2、ppp1-4、ppp1-5）分别与靶细胞293t-ppp1及反筛选细胞293t进行孵育，使用荧光显微镜对其结合情况进行观察。结果如图3及4所示，三条候选适配体与靶细胞293t-ppp1孵育后，细胞膜表面均有较强的绿色荧光表达，其中以ppp1-4荧光强度最亮；而与对照细胞293t孵育后，细胞膜表面并没有绿色荧光表达。该结果证明，这三条候选适配体均有较强的结合能力，并且以ppp1-4结合能力最强，结果表明，本发明将候选适配体ppp1-4作为重点考察对象。6.胰酶对ppp1-4结合能力的影响为进一步验证ppp1-4的结合位点是否细胞膜表面蛋白，使用胰酶对靶细胞进行预先处理。结果如图5，说明经胰酶消化之后靶细胞293t-ppp1与候选适配体ppp1-4结合的荧光信号有减弱趋势，且这种减弱趋势随着胰酶作用时间加长而程度加剧。结果显示胰酶处理过的细胞表面蛋白遭到破坏，从而影响了适配体ppp1-4与细胞膜表面蛋白的结合，从而抑制了适配体ppp1-4与细胞结合的荧光信号强度。7.测序结果二级结构分析由于适配体与靶细胞结合发挥功能，在很大程度上取决于dna序列的二级结构，因此，在考察一级结构同源性的同时，利用nupack对各个家族dna序列进行了二级结构情况的模拟，模拟环境选择结合缓冲液条件，即一价阳离子浓度为150mm，二价阳离子浓度为4mm，温度为4°c。结果显示，每个家族的适配体序列大多具有相同或相似的二级结构，因此选择了每个家族中具有代表性或重复出现次数较高的适配体序列作为候选适配体，进行fitc荧光标记的候选适配体序列合成。具体候选适配体序列见表2。表2候选适配体序列及其平衡解离常数名称序列（5’-3’）kd(nm)ppp1-1gaattcagtcggacagcgacgcaaggatagtaattaggtttggtgcggtggggtaatttcagcgatggacgaatatcgtctccc46.79±27.15ppp1-2gaattcagtcggacagcggagaatggcgttaagcttttcttcccttgtgtttgattcttaaccgatggacgaatatcgtctccc81.99±26.93ppp1-3gaattcagtcggacagcgtattacaaggctctcagccgagcggccccggctcctaggggaatagatggacgaatatcgtctccc52.30±46.78ppp1-4gaattcagtcggacagcggatcagttttccatgccagttggtattccgcgacagtttgatctcgatggacgaatatcgtctccc5.58±3.11ppp1-5gaattcagtcggacagcgcagtaatcccttgtgtttgatgctcatttctctctgaaattgctcgatggacgaatatcgtctccc38.52±19.728.ppp1-4优化序列设计综上所述，本发明筛选获得的适配体ppp1-4在众多适配体候选序列当中具有最强的结合作用，因此可期待其在今后的肿瘤相关靶向诊断与治疗当中发挥一定的作用。然而，与初始文库相同，ppp1-4是一条具有84bp长度的dna序列，而在各种功能研究当中，dna序列长度越长，稳定性也就越差。不仅如此，合理的去除适配体序列中某些不发挥功能、甚至因空间占位而影响适配体发挥结合作用的碱基序列，对更优适配体的获得至关重要。因此，本发明进一步对ppp1-4进行序列优化，这种优化主要采用序列截短的方式，即将原序列两端引物进行全部或部分去除。优化截短后各适配体序列如表3所示。表3ppp1-4优化截短序列名称序列（5’-3’）ppp1-4gaattcagtcggacagcggatcagttttccatgccagttggtattccgcgacagtttgatctcgatggacgaatatcgtctcccppp1-4agatcagttttccatgccagttggtattccgcgacagtttgatctcgatggacgaatatcgtctcccppp1-4bgaattcagtcggacagcggatcagttttccatgccagttggtattccgcgacagtttgatctcppp1-4cgatcagttttccatgccagttggtattccgcgacagtttgatctc9.ppp1-4优化序列结合能力考察对ppp1-4优化序列进行流式细胞术检测，考察其与靶细胞293t-ppp1的结合情况。结果如图6所示，与原序列相比，ppp1-4a及ppp1-4b对于靶细胞的的结合能力有部分减弱，而ppp1-4c与靶细胞的结合能力没有明显改变。结果表明，本发明获得的适配体序列在发挥结合作用之时，可能并不依ppp1-4c也能与靶细胞293t-ppp1发挥良好的结合作用。并且与原序列相比，截短序列ppp1-4c由于长度缩短，可在一定程度上提高稳定性及避免被降解的能力，因而可能在后续研究中发挥较为出色的靶向效果。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，本发明中涉及的方法对atg16l1、csnk2等肿瘤标志物的核酸适配体筛选同样适用，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。序列表<110>广西医科大学<120>一套基于crispr/cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>84<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>1gaattcagtcggacagcgacgcaaggatagtaattaggtttggtgcggtggggtaatttc60agcgatggacgaatatcgtctccc84<210>2<211>84<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>2gaattcagtcggacagcggagaatggcgttaagcttttcttcccttgtgtttgattctta60accgatggacgaatatcgtctccc84<210>3<211>84<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>3gaattcagtcggacagcgtattacaaggctctcagccgagcggccccggctcctagggga60atagatggacgaatatcgtctccc84<210>4<211>84<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>4gaattcagtcggacagcggatcagttttccatgccagttggtattccgcgacagtttgat60ctcgatggacgaatatcgtctccc84<210>5<211>84<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>5gaattcagtcggacagcgcagtaatcccttgtgtttgatgctcatttctctctgaaattg60ctcgatggacgaatatcgtctccc84当前第1页12