检测对虾虹彩病毒的LAMP引物组、试剂盒及其方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及检测对虾虹彩病毒的lamp引物组、试剂盒及其方法。

背景技术

对虾血细胞虹彩病毒(shrimphemocyteiridescentvirus，shiv)，最早由lightner和redman于1993年在靠近厄瓜多尔的对虾养殖场中的原糙对虾(protrachypeneprecipuaburkenroad)中被发现。

对感染虹彩病毒的原糙对虾进行组织病理学观察发现，原糙对虾的表皮上皮细胞(鳃、胃内层甚至遍布全身)呈现典型的虹彩病毒感染；造血组织、触角腺上皮组织以及心脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰腺中的结缔组织细胞和吞噬细胞也被虹彩病毒感染。

对于该病的防治方法，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的shiv病原检测方法是减少虹彩病发生和危害的重要途径。

目前，对虾是否感染虹彩病毒的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验和细胞培养等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。

近年来，分子生物学出现了一种新的扩增方法-环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)技术，该方法能够依赖识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的dna聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。lamp是notomi等建立的一种新型核酸扩增技术，在60～65℃的恒温条件下，仅需30～60min即可完成核酸扩增反应。lamp反应中可通过加入荧光染料，直接通过荧光信号的变化来判定反应结果。该技术具有以下特点：(1)特异性强：lamp能从仅相差1个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增；(2)等温高效：lamp在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小，与pcr相比，其检测极限更小，仅为几个拷贝；(3)耗时短：在1h内可把靶序列扩增至10⁹倍；(4)产物易检测。lamp因具有高特异性、高效率和快速反应的特点，可以大量扩增所需的靶序列，故被用于水产病毒的检测和传染性疾病的诊断。

申请公开号为cn108034768a的发明专利申请文献公开了一种对虾虹彩病毒套式pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游ivf145：ggagcattgaagttggatac；下游ivr961：gaaggatggatacaacaaca；内引物：上游ivf300：agtaatcggcagtcatcac；下游ivr646：ggtgaatggtggtcttatcc。

申请公开号为cn108018379a的发明专利申请文献公开了一种对虾虹彩病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物：ivqf：caatcatgttgttgtatccatccttct；ivqr：ggtttcattcaacgtaaacgatctcg。

上述两种方法分别基于常规pcr的操作方法和实时荧光定量pcr方法，能够增加对虾虹彩病毒隐性感染时的病原检出率，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测；但是，常规pcr引物特异性不高，容易出现假阳性，且普通pcr需要通过电泳结果来进行判别，仅只能作为定性鉴定，操作过程复杂，且容易造成污染；而荧光定量pcr在一定程度上解决了假阳性的问题，也能够进行定量检测，但是其探针成本过高，且需要用到荧光定量pcr仪，需在实验室完成，不利于野外快速、简便的对对虾虹彩病毒的检测。

本发明lamp检测试剂盒由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，增加了引物的特异性，有效减少假阳性的发生，且不需要预变性与温度循环，在一个温度条件下就可以完成实验，缩短检验时间。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种用于检测对虾虹彩病毒的lamp引物组，该引物组的灵敏度高、特异性高且稳定性好，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

本发明的第二目的在于提供一种用于检测对虾虹彩病毒的试剂盒，该试剂盒同样也具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

本发明的第三目的在于提供一种用于检测对虾虹彩病毒的方法，该方法能够快速高效地进行扩增，不仅操作简便，而且鉴定简便也更为简便。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种检测对虾虹彩病毒的lamp引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列如下所示：

shiv-f3:caatccagaattttacaacttgt；

shiv-b3:tcaatgttggggaatacctt；

shiv-fip:gacttccatccctgaaaacatcattttttaataaaaatcccaatttgatcgc；

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shiv-lb:ggcacgattgatcatcccgaagt。

本发明还提供了一种检测对虾虹彩病毒的试剂盒，包括lamp引物组，所述lamp引物组如上文所述的检测对虾虹彩病毒的lamp引物组。

作为优选，所述lamp引物组中外引物的体积为0.5～2μl、内引物的体积为0.1～1μl、环引物的体积为0.2～1μl。

进一步地，所述试剂盒还包括：lamp反应液，dna聚合酶，核酸荧光染料，阳性对照和阴性对照。

其中，作为优选，所述核酸荧光染料为evagreen。

作为优选，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶；

作为优选，lamp反应液由10mmdntp2～5μl、10×thermopol反应缓冲液2～5μl、150mmmgso4水溶液1～3μl组成；

作为优选，所述阳性对照为含有对虾虹彩病毒atpase基因片段的t载体；

作为优选，所述阴性对照为超纯水。

本发明还提供了一种检测对虾虹彩病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的dna；

(2)利用权利要求1所述检测对虾虹彩病毒的lamp引物组对所述dna进行等温扩增，并根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果。

作为优选，所述待检样品的dna采用研磨法进行提取。

上述方法中，shiv病毒dna的提取可采用研磨法提取上清中的病毒核酸，而不采用蛋白酶消化组织的方法。样品若为成年虾，则主要采集消化腺、前足等，虾苗则直接研磨。对于虾仁的检测，先用匀浆机对数个虾仁进行匀浆，再取少量虾肉进行研磨提取。这样节省了蛋白酶作用的时间，更重要的是消除了大量杂质及色素，减少了对后续lamp反应的抑制。

作为优选，所述等温扩增的反应体系包括：总体积为25μl；其中，10mmdntp3.5μl，10×thermopol反应缓冲液2.5μl，150mmmgso4水溶液1.5μl，bstdna聚合酶0.5μl，10μmshiv-f30.2μl，10μmshiv-b30.2μl，10μmshiv-fip0.8μl，10μmshiv-bip0.8μl，10μmshiv-lf0.4μl，10μmshiv-lb0.4μl，dna模板2μl，余量为ddh2o。

作为优选，所述等温扩增的反应条件为：63℃反应30～60min。

目前，等温扩增采用的荧光染料为sybrgreeni；经实验发现，sybrgreeni对本发明lamp反应会有一定的抑制作用，且在扩增过程中会出现非特异性扩增，故作为优选，所述等温扩增的反应体系中添加的核酸荧光染料为evagreen。

进一步地，所述判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，如果出现“s”型扩增曲线则判定为阳性；如果无“s”型扩增曲线，则判定为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的lamp引物组为六条特异性引物，能够扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体的概率低，保证了反应的顺利进行；最低检测极限可达到1fg/μl。

(2)本发明检测方法快速高效，只需30～60min即可完成整个扩增过程，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝。

(3)本发明检测方法操作简便，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链dna的变性等繁琐步骤，只需要控制反应温度为63℃就能反应和检测，条件比较温和。

(4)本发明检测方法鉴定简便，通过加入evagreen，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

附图说明

图1为实施例1中等温扩增反应后的荧光检测结果。

图2为实施例1中引物特异性实验的结果。

图3为实施例1中不同方法的灵敏度实验；

其中，a：lamp检测；b嵌套pcr检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、实验材料

样本1：于2017.06.16在平湖获取的成年大虾。

样本2：于2018.04.02在杭州获取的虾苗。

阳性质控品：核苷酸序列如seqidno.7所示。

2、对虾虹彩病毒dna的提取

(1)称取30mg的实验样本(样本1取腮腺、样本2取整颗虾苗)，加入500μl的生理盐水，颠倒混匀后去除液体，重复该步骤一次；

(2)将洗净的虾苗置于研磨管中，加入一颗研磨珠(直径8mm)，加入100μl的裂解液，放入均质仪中，以6m/s匀浆20s；

(3)再加入100μl的裂解液，并加入20μl的蛋白酶k，56℃温浴1h；

(4)加入200μl的结合液，70℃下放置10min；

(5)加入200μl的无水乙醇，颠倒混匀后加入吸附柱中，12000rpm离心30s；

(6)倒掉废液，向吸附柱中加入500μl的盐洗液，12000rpm离心30s；

(7)倒掉废液，向吸附柱中加入600μl的漂洗液，12000rpm离心30s；

(8)重复步骤7；

(9)彻底晾干漂洗液，加入100μltebuffer，离心，得到对虾虹彩病毒dna。

3、lamp引物的设计

通过http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html该网站进行引物设计，获得一组lamp引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列如下所示(seqidno.1～6)：

shiv-f3:caatccagaattttacaacttgt；

shiv-b3:tcaatgttggggaatacctt；

shiv-fip:gacttccatccctgaaaacatcattttttaataaaaatcccaatttgatcgc；

shiv-bip:aactcccaatcgattacattgactttttgaaaaagttgtctactgcga；

shiv-lf:cgaaatcgtatacaccgttcttgaa；

shiv-lb:ggcacgattgatcatcccgaagt。

4、等温扩增反应

反应体系如表1所示(总体积25μl)：

表1lamp反应体系

将上述试剂混合后，加入20μl石蜡油密封液，混匀离心，盖紧管盖。

5、荧光检测的方法和结果

检测方法：

将配制好的反应管离心，置于abistepone仪器中，设置程序，程序如下：

检测结果：

根据实验结果，出现“s”型曲线的为阳性，无“s”型曲线的则为阴性，两个实际样本和阳性质控品都出现了“s”型曲线，而阴性对照未出现扩增(如图1所示)。

上述方法中外引物扩增产物的核苷酸序列如seqidno.8所示；内引物扩增产物的核苷酸序列如seqidno.9所示。

6、引物特异性实验

检测方法：

为检测本试剂盒的引物特异性，采用上述lamp检测方法，分别对对虾白斑综合症病毒(wssv)、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)、对虾肠胞虫病(ehp)、shiv进行检测，分析本试剂盒对shiv病毒和对虾其他常见病毒的检测情况。

检测结果：检测结果表明，仅病毒shiv样品出现“s”型扩增曲线，阴性对照(超纯水)及病毒wssv、ihhnv、ehp样品均未出现扩增(如图2所示)。上述实验结果说明，本lamp检测试剂盒能特异性扩增出病毒shiv中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。

7、灵敏度实验

检测方法：

提取阳性质粒(含有靶序列片段的t载体)，通过nanodropone对阳性质粒进行定量，并将其分别稀释到10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl、10ag/μl、1ag/μl。分别采用上述lamp检测方法和嵌套pcr检测方法(liangqiu,meng-mengchen,xiao-yuanwan,etal.scientificreports.2017,7:11834)，对稀释后的各浓度阳性质粒进行扩增检测。

嵌套pcr引物及扩增程序(scientificreports.2017,7:11834)

检测结果：lamp检测结果如图3a所示，从左到右的曲线依次为10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的lamp试剂盒检测的灵敏度可达1fg/μl，而套式pcr的实验结果如图3b，左侧为外引物扩增产物，其目的片段为457bp，右侧为内引物扩增产物，其目的片段为129bp，分析表明套式pcr的检测灵敏度为10fg/μl。

通过两者检测方式的对比，表明lamp检测方法的精确性优于普通pcr检测方法，证明本发明的lamp试剂盒和检测方法对病毒shiv的诊断具有高度的灵敏性。

序列表

<110>杭州奥盛仪器有限公司

浙江科技学院

浙江省水产技术推广总站

<120>检测对虾虹彩病毒的lamp引物组、试剂盒及其方法

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