本发明属于生物医药领域，具体涉及一种原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料的制备方法及其应用。
背景技术：
：：活性氧簇(ros)，也称作活性氧，是机体生理活动的代谢产物，但过多的ros对多种疾病，如炎性疾病、心血管疾病、衰老、糖尿病、肿瘤和神经退行性紊乱的发生发展有重大影响1-5。鉴于ros对机体健康存在的潜在威胁，及时检测以及有效清除ros，对监控和治疗与ros水平相关疾病具有非常重要的意义6-10。近年来，ros响应性药物递送系统材料开发层出不穷，这种利用疾病特定微环境控制药物靶向释放的方法具有广阔的应用前景11-13。光动力治疗(photodynamictherapy,pdt)是一种以光、光敏剂和氧三者相互作用为基础的非侵袭性治疗手段，除常用于治疗肿瘤外，对多种非恶性疾病，如针对皮肤病、心血管疾病、眼科疾病等亦有良好的治疗效果14-18。第二代光敏剂二氢卟吩e6，其被相匹配光源激发后，能产生具有细胞毒的活性氧簇，介导细胞凋亡、坏死，进而发挥光动力治疗作用。与此同时，伴随激发态的电子跃迁回基态发射出近红外荧光可以进行光学成像。因此二氢卟吩e6在进行光动力治疗的同时也能进行荧光成像分析，将诊断和治疗有效结合于一体13,19,20。为克服二氢卟吩e6光学特性固有的局限性，又发展了诸如上转换体系、自发光体系、双光子激发体系等方法以改善光源组织穿透较差的问题21-25。自发光在病灶原位成像且不需外部光源的激发，避免了机体自发荧光的干扰，提高了精准度和信噪比26-28。对ros有特异响应性的鲁米诺及其衍生物是广泛使用的化学发光试剂29-32。这类物质通过氧化产生α-羟基过氧化物中间体释放光能。此特性被广泛运用于分化、临床诊断等诸多领域，常用于定量分析ros水平33,34。但其最大发射波长为425nm，波长较短，光波组织穿透性较差，限制了在体成像的应用。通过化学发光共振能量转移效应将鲁米诺或其衍生物化学自发光部分能量转移到受体分子，激发长波长光波，将利于深层组织的光学成像35,36。技术实现要素：针对上述问题，本发明的目的在于公开一种原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料及其制备方法。本发明的再一目的是验证其在与ros和髓过氧化物酶(mpo)水平相关疾病中的成像与光动力治疗作用。为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料，其化学结构如下：其中:r1、r2、r3中至少含有一个①或②，其总数≤3。其中①为②为n＝5～450。一种原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料的制备方法，包括以下步骤：(1)以二氢卟吩e6为初始原料，氮气保护下，依次加入10～20倍量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺，在有机溶剂i中,于0～50℃反应12～24小时，得到羧基被活化的二氢卟吩e6中间体；(2)氮气保护下，在步骤(1)反应器中加入2～20倍量二氢卟吩e6的鲁米诺或其衍生物，于0～50℃下反应24～100小时，得到鲁米诺或其衍生物取代的二氢卟吩e6化合物；(3)氮气保护下，在步骤(2)反应器中加入2～20倍量二氢卟吩e6的聚乙二醇，于0～50℃反应24～100小时，得到以二氢卟吩e6键合鲁米诺或其衍生物为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；(4)将步骤(3)所得两亲性聚合物转移到透析袋中，超纯水透析48～100小时直至除去残留溶剂、未反应原材料及中间产物，收集溶液，于-60～-55℃环境下冷冻干燥，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。所述步骤(1)中的有机溶剂i为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、乙腈或吡啶。所述步骤(2)中二氢卟吩e6与鲁米诺或其衍生物的摩尔数之比为1:2～20。所述步骤(3)中的聚乙二醇为一端是胺基的聚乙二醇，其分子量介于400～20000；二氢卟吩e6与聚乙二醇的摩尔数之比为1:2～20。本发明所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在成像和防治高活性氧簇水平相关疾病中的应用。利用相关疾病高ros和高mpo水平微环境，鲁米诺或其衍生物被氧化，肼键断裂发出光子，基于共振能量转移效应，激发能量受体二氢卟吩e6发射近红外荧光并伴随单线态氧的产生，发挥自发光成像和光动力治疗作用。其中所述的高ros和高mpo水平相关疾病包括炎症性疾病和肿瘤。本发明以活化后的腹腔中性粒细胞、药物介导的急性肝损伤、动脉粥样硬化和a549异位肿瘤为模型，验证本发明在高ros和高mpo水平相关疾病中的自发光成像和光动力治疗作用。本发明的有益技术效果包括：(1)所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料，具有ros和mpo特异响应性，选择性作用于高ros和高mpo浓度微环境，而在低浓度条件下不发生响应；(2)所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料极大地改善了光敏剂二氢卟吩e6溶解度，使用方便，给药途径多样化；(3)所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料特异性作用于高ros和高mpo微环境发挥自发光成像和光动力治疗作用，能有效靶向富集于病灶部位，涵盖疾病类型宽广；(4)所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料具备多模态成像潜力；(5)所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料还可作为药物递送载体材料，以发挥联合治疗的目的；(6)所述原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料合成方法简单，制备工艺稳定可控，易于规模化合成。附图说明图1是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在氘代二甲基亚砜溶剂中的1hnmr图谱；图2是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在水溶液中自组装形成纳米粒的透射电子显微镜(tem)照片；图3是能量供体鲁米诺自发光光谱与能量受体二氢卟吩e6紫外吸收光谱重叠图谱；图4是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料对活化后的中性粒细胞进行自发光成像；图5是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在急性肝损伤小鼠体内自发光成像；图6是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料靶向急性肝损伤小鼠肝脏组织荧光成像；图7是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在体外适宜氧化环境中自发产生单线态氧统计结果；图8是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料治疗载脂蛋白e基因缺陷(apoe-/-)小鼠动脉粥样硬化主动脉油红染色斑块面积统计图；图9是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料治疗荷a549异位移植瘤的瘤体体积变化图；图10是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料治疗荷a549移植瘤的瘤体重量统计图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不脱离本发明技术思想和实质的情况下，根据本领域普通技术实质和惯用手段，对本发明方法、步骤或条件做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1在氮气保护下，0.1mm二氢卟吩e6与1mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺在5ml无水二甲基亚砜中，0℃反应12小时得到羧基被活化的二氢卟吩e6中间体；加入0.2mm鲁米诺(对应
发明内容，①中第一个取代基)，0℃反应24小时得到鲁米诺取代的二氢卟吩e6化合物；然后，再加入0.2mm分子量为400da的端胺基聚乙二醇，0℃反应24小时后得到以二氢卟吩e6键合鲁米诺为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；最后将两亲性聚合物转移到截留分子量为1000da的透析袋中，超纯水中透析48小时，-60℃冷冻干燥，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。实施例2在氮气保护下，0.1mm二氢卟吩e6与1.5mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺在10ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，25℃反应18小时得到羧基活化的二氢卟吩e6中间体；加入1mm异鲁米诺(对应
发明内容，①中第二个取代基)，25℃反应72小时得到异鲁米诺取代的二氢卟吩e6化合物；加入0.5mm分子量为1000da的端胺基聚乙二醇，25℃反应72小时得到以二氢卟吩e6-异鲁米诺为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；两亲性聚合物转移到分子截留量为2000的透析袋中，超纯水中透析72小时，-57℃冻干，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。实施例3在氮气保护下，0.1mm二氢卟吩e6与2mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺在20ml无水n,n-二甲基乙酰胺中，50℃反应24小时得到羧基活化的二氢卟吩e6中间体；加入2mm8-氨基-5-氯-7苯基吡啶并[3,4-二]哒嗪-1,4(2h,3h)二酮(即l-012)(对应
发明内容，①中第三个取代基)，50℃反应100小时得到8-氨基-5-氯-7苯基吡啶并[3,4-二]哒嗪-1,4(2h,3h)二酮取代的二氢卟吩e6化合物；加入2mm分子量为2000的端胺基聚乙二醇，50℃反应100小时得到以二氢卟吩e6/l-012为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；两亲性聚合物转移到分子截留量为5000da的透析袋中，超纯水中透析72小时，-55℃冻干，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。实施例4在氮气保护下，0.1mm二氢卟吩e6与1.8mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺在10ml无水乙腈中，50℃反应17小时得到羧基活化的二氢卟吩e6中间体；加入1mm9-氨基-2,3-二氢苯并[f]酞嗪-1,4-二酮(对应
发明内容，①中第四个取代基)，50℃反应100小时得到9-氨基-2,3-二氢苯并[f]酞嗪-1,4-二酮取代的二氢卟吩e6化合物；加入1mm分子量为5000的端胺基聚乙二醇，50℃反应100小时得到以二氢卟吩e6/9-氨基-2,3-二氢苯并[f]酞嗪-1,4-二酮为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；两亲性聚合物转移到分子截留量为10000da的透析袋中，超纯水中透析96小时，-55℃冻干，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。实施例5在氮气保护下，0.1mm二氢卟吩e6与1.8mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺在12ml无水四氢呋喃中，50℃反应17小时得到羧基活化的二氢卟吩e6中间体；加入1.6mm鲁米诺(对应
发明内容，①中第一个取代基)，50℃反应100小时得到鲁米诺取代的二氢卟吩e6化合物；加入1.5mm分子量为5000的端胺基聚乙二醇，50℃反应100小时得到以二氢卟吩e6-鲁米诺为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；两亲性聚合物转移到分子截留量为20000da的透析袋中，超纯水中透析72小时，-55℃冻干，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。实施例6在氮气保护下，0.1mm二氢卟吩e6与1.8mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺在10ml无水吡啶中，50℃反应17小时得到羧基活化的二氢卟吩e6中间体；加入1mm异鲁米诺(对应
发明内容，①中第二个取代基)，50℃反应100小时得到异鲁米诺取代的二氢卟吩e6化合物；加入0.6mm分子量为3000的端胺基聚乙二醇，50℃反应100小时得到以二氢卟吩e6-异鲁米诺为疏水单元、聚乙二醇为亲水段的两亲性聚合物；两亲性聚合物转移到分子截留量为10000da的透析袋中，超纯水中透析72小时，-55℃冻干，得到活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料。图1是二氢卟吩e6(ce6)、鲁米诺和聚乙二醇反应得到的原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在氘代二甲基亚砜中的1hnmr图谱。其中编号a-b对应二氢卟吩e6双键上的质子峰信号；c对应的是鲁米诺苯环上的质子峰信号；该谱图表明得到了预期结构的产物。实施例7取二氢卟吩e6与鲁米诺和分子量为2000da的端胺基聚乙二醇反应得到的原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料溶解在水溶液中，自组装形成胶束样纳米粒，透射电镜照片见图2。照片显示聚集体形态圆整，粒径大小均一，呈明显的核壳结构。图3二氢卟吩e6吸收光谱(3a)和鲁米诺自发光光谱(3b)作归一化处理后相叠加的图谱。以上制备的原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物性材料，通过图4到图10进行验证试验。图4是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料对活化后的中性粒细胞进行自发光成像的图片。用浓度为100ng/ml的佛波酯刺激腹腔灌洗液中的中性粒细胞1小时，得到活化的中性粒细胞。采集自发光信号后，吸取培养基单独于一空白孔中，再次用成像系统收集自发光信号。结果表明原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物能选择性检测胞内的高ros水平；对低ros水平的培养基不响应而几乎无自发光。图5是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在急性肝损伤小鼠体内自发光成像结果。c57bl/6小鼠，雄性，禁食15小时，对乙酰氨基酚300mg/kg的剂量进行腹腔注射，24小时后，得小鼠急性肝损伤模型。结果表明原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物能有效对急性肝损伤小鼠进行自发光成像，其自发光强度显著高于作为对照组的鲁米诺。图6是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料靶向急性肝损伤小鼠肝脏组织的荧光成像图片。结果表明，聚合物在肝脏有大量聚集，证实了活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物通过尾静脉给药途径能有效靶向并富集到目标组织。图7是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料在体外适宜氧化环境中自发产生单线态氧的测定结果。以9,10-二苯基蒽(dpa)为单线态氧捕获剂，测定紫外吸收变化值。结果表明，随过氧化氢溶液浓度的增大，单线态氧的产量增加。图8是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料治疗apoe-/-小鼠动脉粥样硬化中主动脉油红染色斑块面积统计结果图。结果表明，经过为期2个月的治疗，给予原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物治疗的小鼠主动脉斑块面积显著性少于对照组。说明原位光动力治疗能有效缓解小鼠动脉粥样硬化斑块的发展。图9是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料治疗荷a549移植瘤小鼠瘤体体积的统计结果。结果表明，治疗组的小鼠瘤体体积显著小于对照组。图10是原位活性氧和髓过氧化物酶响应性自发光聚合物材料治疗荷a549移植瘤小鼠瘤体重量统计。治疗组的瘤体组织重量显著性小于对照组，结果表明，依靠于肿瘤内部高ros微环境，聚合物自发产生单线态氧导致肿瘤细胞凋亡，从而在一定程度上抑制了肿瘤的发展。参考文献1.taniyama,y.&griendling,k.k.reactiveoxygenspeciesinthevasculature.hypertension42,1075-1081(2003).2.mantel,c.etal.mousehematopoieticcell–targetedstat3deletion:stem/progenitorcelldefects,mitochondrialdysfunction,rosoverproduction,andarapidaging–likephenotype.blood120,2589-2599(2012).3.houstis,n.,rosen,e.d.&lander,e.s.reactiveoxygenspecieshaveacausalroleinmultipleformsofinsulinresistance.nature440,944-948(2006).4.qian,b.-z.&pollard,j.w.macrophagediversityenhancestumorprogressionandmetastasis.cell141,39-51(2010).5.block,m.l.,zecca,l.&hong,j.-s.microglia-mediatedneurotoxicity:uncoveringthemolecularmechanisms.naturereviewsneuroscience8,57-69(2007).6.cao,j.,an,w.,reeves,a.g.&lippert,a.r.achemiluminescentprobeforcellularperoxynitriteusingaself-immolativeoxidativedecarbonylationreaction.chemicalscience9,2552-2558(2018).7.cheng,g.etal.detectionofmitochondria-generatedreactiveoxygenspeciesincellsusingmultipleprobesandmethods:potentials,pitfalls,andthefuture.thejournalofbiologicalchemistry(2018).8.yik-shamchung,c.,timblin,g.a.,saijo,k.&chang,c.j.versatilehistochemicalapproachtodetectionofhydrogenperoxideincellsandtissuesbasedonpuromycinstaining.jamchemsoc(2018).9.vong,l.b.etal.novelangiogenesistherapeuticsbyredoxinjectablehydrogel-regulationoflocalnitricoxidegenerationforeffectivecardiovasculartherapy.biomaterials167,143-152(2018).10.chen,j.etal.areloadableself-healinghydrogelenablingdiffusivetransportofc-dotsacrossgel-gelinterfaceforscavengingreactiveoxygenspecies.advancedhealthcarematerials6(2017).11.liang,x.etal.improvedvaccine-inducedimmuneresponsesviaaros-triggerednanoparticle-basedantigendeliverysystem.nanoscale(2018).12.yu,l.,yang,y.,du,f.s.&li,z.c.ros-responsivechalcogen-containingpolycarbonatesforphotodynamictherapy.biomacromolecules(2018).13.yang,x.,shi,x.,ji,j.&zhai,g.developmentofredox-responsivetheranosticnanoparticlesfornear-infraredfluorescenceimaging-guidedphotodynamic/chemotherapyoftumor.drugdelivery25,780-796(2018).14.agostinis,p.etal.photodynamictherapyofcancer:anupdate.ca:acancerjournalforclinicians61,250-281(2011).15.huang,y.y.etal.photodynamictherapyinducesanimmuneresponseagainstabacterialpathogen.expertreviewofclinicalimmunology8,479-494(2012).16.tanaka,m.etal.photodynamictherapyusingintra-articularphotofrinformurinemrsaarthritis:biphasiclightdoseresponseforneutrophil-mediatedantibacterialeffect.lasersinsurgeryandmedicine43,221-229(2011).17.tanaka,m.etal.linezolidandvancomycindecreasethetherapeuticeffectofmethyleneblue-photodynamictherapyinamousemodelofmrsabacterialarthritis.photochemistryandphotobiology89,679-682(2013).18.yeager,d.,chen,y.s.,litovsky,s.&emelianov,s.intravascularphotoacousticsforimage-guidanceandtemperaturemonitoringduringplasmonicphotothermaltherapyofatheroscleroticplaques:afeasibilitystudy.theranostics4,36-46(2013).19.xia,f.etal.cytokineinducedkillercells-assisteddeliveryofchlorine6mediatedself-assembledgoldnanoclusterstotumorsforimagingandimmuno-photodynamictherapy.biomaterials170,1-11(2018).20.hu,d.etal.oxygen-generatinghybridpolymericnanoparticleswithencapsulateddoxorubicinandchlorine6fortrimodalimaging-guidedcombinedchemo-photodynamictherapy.theranostics8,1558-1574(2018).21.xu,j.etal.near-infrared-triggeredphotodynamictherapywithmultitaskingupconversionnanoparticlesincombinationwithcheckpointblockadeforimmunotherapyofcolorectalcancer.acsnano11,4463-4474(2017).22.lucky,s.s.etal.invivobiocompatibility,biodistributionandtherapeuticefficiencyoftitaniacoatedupconversionnanoparticlesforphotodynamictherapyofsolidoralcancers.theranostics6,1844-1865(2016).23.gu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