本发明涉及分子生物学和微生物检测技术领域，尤其涉及一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒。
背景技术
产气肠杆菌（enterobacteraerogenes，eae）属于肠杆菌科肠杆菌属，为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，是一种条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位，可引起呼吸道、泌尿生殖道、血液等感染，也是老年人感染或院内获得性肺炎的常见致病菌。产气肠杆菌可以产生b一内酰胺酶，多年来由于抗生素的滥用，该类细菌引起医院感染的概率不断上升，已成为院内感染常见的条件致病菌。
传统的诊断产气肠杆菌的方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判定，不利于及时找到病原，诊断病因。pcr技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增dna或rna片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。taqmanfam探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于产气肠杆菌的快速检测。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、特异性好的用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒。
为解决上述问题，本发明所述的一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒，包括
—pcr反应液，由12mmtris-hcl（ph8.9）、100mmkcl、0.12%tritonx-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mlbsa、1.8mmmgcl2、50nmdntp、500nm上游引物、500nm下游引物、300nmtaqman探针组成；
其中上游引物序列为5'-cgctgtacgcttcatctatt-3'；下游引物序列为5'-gacgctgtatgccgaggtt-3'；探针序列为5’-ttccctttgcctaacatatctaccgttt-3’；
—酶混合液，由5u/µltaqdna聚合酶，50%甘油，20mmtris-hcl(ph8.0,25℃)，100mmkcl，0.1mmedta，1mmdtt，0.5%tween®20和0.5%np-40组成；
—产气肠杆菌cad基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；
其中cad基因标准品序列为5’-cgctgtacgcttcatctattttccctttgcctaacatatctaccgtttttatctggtagaaaatcgccatatctttaatgccgggcattttacctactttttcaacctcggcatacagcgtc-3’；
—阴性对照品，由水组成；
—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。
所述上游引物和所述下游引物为包括引物序列的互补链序列。
所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
所述探针中5’端标记的荧光报告基团为fam、tet、joe、hex、vic中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq、dabcyl、tamra中的一种。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用基因克隆技术，将产气肠杆菌cad基因片段插入到载体pmd18-t中，获得含有cad基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据产气肠杆菌cad基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化pcr反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。
2、本发明通过提取产气肠杆菌的基因组dna，结合实时荧光定量pcr检测技术，可达到准确定量待测标本中产气肠杆菌含量的目的，对判断产气肠杆菌活性菌的含量以及后续研究泌尿道感染具有重要意义。
3、本发明快速、灵敏、特异性好。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明灵敏度实验结果。a代表质粒浓度分别为1.00×109copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×108copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×107copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、g代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、h代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照。
图2为本发明探针特异性实验结果。其中a标准扩增曲线的为产气肠杆菌基因组，b代表未出现标准扩增曲线分别为鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照。
图3为本发明产气肠杆菌凝胶成像电泳图。从左到右依次为鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、dl2000的marker、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、产气肠杆菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照。
图4为本发明产气肠杆菌标准曲线。
具体实施方式
一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒，包括
—pcr反应液，由12mmtris-hcl（ph8.9）、100mmkcl、0.12%tritonx-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mlbsa、1.8mmmgcl2、50nmdntp、500nm上游引物、500nm下游引物、300nmtaqman探针组成；
其中上游引物序列为5'-cgctgtacgcttcatctatt-3'；下游引物序列为5'-gacgctgtatgccgaggtt-3'；探针序列为5’-ttccctttgcctaacatatctaccgttt-3’；
—酶混合液，由5u/µltaqdna聚合酶，50%甘油，20mmtris-hcl(ph8.0,25℃)，100mmkcl，0.1mmedta，1mmdtt，0.5%tween®20和0.5%np-40组成；
—产气肠杆菌cad基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；
其中cad基因标准品序列为5’-cgctgtacgcttcatctattttccctttgcctaacatatctaccgtttttatctggtagaaaatcgccatatctttaatgccgggcattttacctactttttcaacctcggcatacagcgtc-3’（seqidno.2）；
—阴性对照品，由水组成；
—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。
其中：上游引物和下游引物可为包括引物序列的互补链序列。
上游引物和下游引物也可为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
探针中5’端标记的荧光报告基团为fam、tet、joe、hex、vic中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq、dabcyl、tamra中的一种。
下述实验例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。
实例1cad基因标准品的制备
要建立实时荧光定量pcr方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。基因广泛存在于产气肠杆菌中，具有很高的保守性。本研究采用产气肠杆菌cad基因作为靶序列。本部分主要采用pcr技术扩增产气肠杆菌cad基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pmd18-t中，构建出重组质粒pmd18-t-cad，并进行相应的pcr鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、模板dna的制备
提取产气肠杆菌（标准菌株）基因组dna，用作cad基因pcr扩增的模板。
①取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管，8000r/min离心2分钟，弃上清液。
②加入400ulbufferdigestion悬浮菌液沉淀，混匀后放入65℃水浴1h至细胞完全裂解。
③加入200ulbufferpb混匀-20℃静置5min，离心取上清。
④加入600ul异丙醇混匀-20℃静置5min。离心弃上清。
⑤加入1ml75%乙醇-20℃静置5min。离心弃上清。
⑥沉淀用75%的乙醇洗涤，干燥。
⑦溶于50ultebffer中，-20℃保存。
二、cad基因片段的pcr扩增
1、引物的设计与合成
本发明通过对ncbi数据库中产气肠杆菌cad基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用primerexpress3软件、primerpremier5软件以及beacondesigner7软件，设计了一组实时荧光定量pcr引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
所选取的扩增序列具有序列表中seqidno.1第1位到1526位所示的核苷酸序列。
seqidno.1
1ttattctgaagcgaggaaattgtcgagatacggtactacgcgggtgacggaggtctggaa
61tactccgttttcaatccagtacaaggtgttttcgccagggcgtaaattaaacgccgtcag
121gtaggcatcggcagcttcgcggttctgtcctttcatctcataaacttttccgagcagcac
181gtaattcatccacgacatttctaaatcaatgcccgtgttgatcgcgctgtacgcttcatc
241tattttccctttgcctaacatatctaccgtttttatctggtagaaaatcgccatatcttt
301aatgccgggcattttacctactttttcaacctcggcatacagcgtcgtaattgtttttca
361tccaacggctgctgcgaatgacgtaatacatccaccagcgctttttcggcgtaagcataa
421ataaagtccggcgattgtttaatgacgtcatcaagtatatcgctggctttacctaatgaa
481tcgacatcacctttcattaacagctgatgggcctgataaagacgggttaatgaagggctt
541tgcgcgggttgatactgtttcagcatcgctttcatgcgatccggccacggctgcattagc
601gcggttgacagactatccagcaggtcattctgaatggtgagctggttatccatggtaata
661aagtagcgtttatcgagcatcgtcgagccgtcggcgttatcgaccagttgcaccgacata
721aagcactgctgggcgcgatagtggcgctgattaacgaattcgatggtcaacgttttaccc
781gaactgctgggctcgttgatgttgtagttcgttttatcgtggaccataaaggtcgagaaa
841gtgttgagcgaggtggttaccaggctgcccaaccctaccgcataggcatgctgcgatgcc
901cagttgttgcatgaactgccgtttaccaggtgtatgtcgatatcgcgcgggttgagcagc
961aggcgagttttggtttccggcggccgcgattctatcgacgacaaagcaactaacgcgacg
1021caactgcccaacgccagcaggaatagcgtccatacccaaaaggtggtgatccgtttacgt
1081ttttccggcactgccgccgccgctggcgcagcagatgaaggagaaatagtcggtggcgac
1141gtttcaggaacggtgacaggggccactggcgggacaaccggcgccaactcttcgccctct
1201tccgtacaccaaattaccgggaccgtcagcttgtagccgcgtttgggcaccgtcgcaata
1261tattccatgctgccgtcatcaccgtctttcagtgatttacgcaactcggaaatactttgg
1321gtgacgacatggctggtcaccacgttgcgcgtccagacgtgatcgataagctcgtcccgg
1381ctaagtacctcgccaggatgttgagcaaagtagaccagaagatcgattaaacgcggttcg
1441agagtaagctgacgtccgttccggctaatttggtttacagaaggagtaacgagccattcc
1501ccaacgcgaacaacaggttgttgcat
该外围引物序列如下：
上游引物：cad-225f5'-cgctgtacgcttcatctatt-3'
下游引物：cad-346r5'-gacgctgtatgccgaggtt-3'
扩增片段大小为：122bp。
2、pcr反应体系和反应条件
以dna为模板，以上述外围引物cad-225f/cad-346r为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行pcr扩增。pcr体系如表1。
表1
其中引物采用cad-225f/cad-346r，taq酶采用北京百泰克powertaqplusdnapolymerse，pcr扩增仪为杭州朗基科学仪器有限公司mg系列96梯度pcr仪。
扩增程序/反应条件：
94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min，取5μl扩增产物进行2%琼脂糖电泳，检测pcr产物大小，然后采用上海生工公司生产的dna凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的pcr扩增产物。
三、重组质粒pmd18-t-cad的构建和转化
1、连接反应：将上述纯化得到的pcr扩增产物与pmd18-t（大连宝生物公司）进行连接，采用如下连接体系（表2）进行配制：
表2
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
2、pmd18-t-cad质粒的转化以及pcr鉴定
从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的dh5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻。
①取连接产物10μl加入100μl的dh5α感受态细胞中。
②42℃水浴中热休克90s，热休克后立即置冰上冷却30min。
③向1.5mlep管中加入预冷的800μl的lb液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃140rpm轻摇培养1h。
④将上述培养液8000rpm离心1min,弃上清，将细胞重悬吸收剩余涂布于0.1ngamp的lb平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。
⑤次日观察，从平板上挑取单克隆菌落于100μllb液体培养基（含氨苄青霉素）的pcr管中，37°c振荡培养2-3小时。吸取2μl作为模板进行pcr鉴定，剩余的菌液加入到20ml的lb液体培养基中进行扩摇。
⑥用产气肠特异性引物cad-225f/cad-346r扩增上述稀释菌液，pcr产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，通过检测pcr产物大小鉴定阳性转化子。
引物cad-225f/cad-346r序列如下：
上游引物；cad-225f5'-cgctgtacgcttcatctatt-3'
下游引物；cad-346r5'-gacgctgtatgccgaggtt-3'
体系如表3：
表3
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。
采用百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
实例2实时荧光定量pcr检测产气肠杆菌方法的初步建立
一、特异性引物和探针的设计与合成
以上述选取的产气肠杆菌的cad基因的保守片段为靶目标，应用primerexpress3软件、primerpremier5软件以及oligo7软件，设计了一组实时荧光定量pcr引物和探针。
作为本发明的核心，一组用于产气肠杆菌实时荧光pcr检测的引物和探针核苷酸序列如下：
上游引物：cad-225f5'-cgctgtacgcttcatctatt-3'
下游引物：cad-346r5'-gacgctgtatgccgaggtt-3'
探针：cad225-3465'-ttccctttgcctaacatatctaccgttt-3'
该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：
5’-cgctgtacgcttcatctattttccctttgcctaacatatctaccgtttttatctggtagaaaatcgccatatctttaatgccgggcattttacctactttttcaacctcggcatacagcgtc-3’
二、标准品的获取和定量
1、取将冻存的含有重组质粒的大肠杆菌dh5α100μl转种于5ml的lb液体培养基，37℃200rpm过夜摇培。
2、取1ml培养过夜的菌液转种于10mllb液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒。
3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计（nd5000）对提取的质粒进行测定，测定a260、a280，根据a260/a280判断质粒的纯度。
4、质粒pmd18-t-cad浓度（拷贝数）计算
⑴质粒的分子量=2814bp×660（每对碱基的平均分子量）
⑵测得质粒浓度为194.22ng/μl，质粒纯度a260/a280=1.82，因在进行实时荧光定量pcr时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。
质粒copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
其中阿伏伽德罗常数=6.02×1023copies/mol。
因此提取的质粒浓度copies/ml=194.22×10-9g/ml×6.02×1023copies/mol÷（2814bp×660g/bp•mol）=6.29×1010copies/ml
10μl质粒+52.9的无菌水就得到浓度为1.00×109copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。
【方法评估】
1、灵敏度实验
将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×109copies/ml、1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml、1.00×103copies/ml、1.00×102copies/ml等作为梯度模板。反应体系如表4：
表4
反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图1，数据显示当质粒浓度达到1.00×103copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×102copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×103copies/ml。
2、特异性实验
为了证实本发明对产气肠杆菌检测的特异性，我们选取了其他常见临床感染微生物特异性实验，选取的微生物包括：鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌。
该特异性试验包括用上述样本的基因组dna为模板进行的试验。上述微生物的dna提取均采用上海生工细菌基因组dna快速提取试剂盒（c317ka2364），采用博日公司生产的2×real-timepcrpremixture（probe）实时荧光定量pcr试剂盒进行实验，反应体系如表5：
表5
反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图2结果以基因组dna为模板仅产气肠杆菌检测为阳性，其余微生物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表6。
表6
3、产气肠杆菌探针凝胶成像电泳图
为了证实本发明对产气肠杆菌检测的特异性，我们选取了其他常见临床感染微生物特异性实验，选取的微生物包括：鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌。
配制2%的琼脂糖胶检测产气肠杆菌特异性引物探针荧光定量结果。以特异性实验的扩增产物为模板。结果参考图3，结果以基因组dna为模板仅产气肠杆菌检测为阳性，其余微生物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。
4、标准曲线制备
以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以pcr反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（ct）为纵坐标得到产气肠杆菌检测的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准，结果如图4所示。标准曲线原始方程为y=a+bx，本次标准曲线的方程为y=50.343-1.70x。
<110>苏州百源基因技术有限公司
<120>一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒
<160>2
<210>1
<211>1526
<212>dna
1ttattctgaagcgaggaaattgtcgagatacggtactacgcgggtgacggaggtctggaa
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961aggcgagttttggtttccggcggccgcgattctatcgacgacaaagcaactaacgcgacg
1021caactgcccaacgccagcaggaatagcgtccatacccaaaaggtggtgatccgtttacgt
1081ttttccggcactgccgccgccgctggcgcagcagatgaaggagaaatagtcggtggcgac
1141gtttcaggaacggtgacaggggccactggcgggacaaccggcgccaactcttcgccctct
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1261tattccatgctgccgtcatcaccgtctttcagtgatttacgcaactcggaaatactttgg
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1381ctaagtacctcgccaggatgttgagcaaagtagaccagaagatcgattaaacgcggttcg
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<211>122
<212>dna
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