一种禽腺病毒、一种四联疫苗及其制备方法与流程

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽腺病毒、一种新型鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊和禽腺病毒四联疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫是新城疫病毒引起的，一种引起禽类的以呼吸道、消化道黏膜出血为特征的高度接触性、急性败血性传染病。同时感染其他病原如h9亚型禽流感，可引起内源性感染，将会使产蛋鸡产蛋量下降，育成鸡死亡率增加，是危害我国养禽业的主要疫病之一。

h9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别是新城疫、大肠杆菌混合感染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。

鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒引起的主要危害幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病，可引起严重的免疫抑制，其危害非常严重，造成较大的经济损失。本病的突出表现是鸡群突然发病，采食量锐减，死亡率增高。鸡群的饲养管理条件越差，发病年龄越小，或伴发有其他疾病，如新城疫、禽流感等，死亡率就越高。

腺病毒科根据形态结构、免疫学特性和宿主范围可划分为两个属：哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。禽腺病毒是禽腺病毒属的代表种，由12个血清型病毒株组成，感染鸡后可呈明显症状或不具有明显症状。与该病毒有关的主要临床和病理症候群包括肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋减少。随着我国禽业养殖规模的不断扩大，因禽腺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。

如何能有效预防上述四种病毒对禽类的感染，对养禽业来说是亟需解决的一个技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种禽腺病毒；并用该病毒株来制备新城疫、传染性法氏囊病、h9亚型禽流感四联灭活疫苗，从而弥补现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种禽腺病毒，该病毒毒株于2018年04月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为禽腺病毒ⅰ群血清4型dc株(a/chicken/hebei/dc/2015株)，保藏编号为：cgmccno.15589。

一种疫苗，其包括灭活的禽腺病毒ⅰ群血清4型cgmccno.15589。

该疫苗是由禽腺病毒ⅰ群血清4型dc株cgmccno.15589，接种接种lmh细胞后收取病毒液，经甲醛灭活后，将该病毒液加油佐剂混合乳化制成疫苗。

一种疫苗，其包括灭活的禽腺病毒ⅰ群血清4型cgmccno.15589和灭活的鸡新城疫病毒株、灭活的h9亚型禽流感病毒株或灭活的传染性法氏囊病毒株中的任一种或两种。

一种四联疫苗，其包括灭活的鸡新城疫病毒株、灭活的h9亚型禽流感病毒株、灭活的传染性法氏囊病毒株和灭活的禽腺病毒ⅰ群血清4型。

优选地，所述禽腺病毒ⅰ群血清4型为dc株，其保藏编号为cgmccno.15589，其病毒含量≥10^7.0tcid50/0.1ml。

优选地，所述鸡新城疫病毒株为lasota株，其病毒含量为10^8.5至10^9.1eid50/0.1ml。

优选地，所述h9亚型禽流感病毒株为bx13株，其病毒含量≥10^8.0eid50/0.1ml，ha价≥1:512。

优选地，所述传染性法氏囊病毒株为bjq902株，其病毒含量≥10^7.5tcid50/0.1ml。

如上所述的四联疫苗的制备方法，具体为将鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒接种鸡胚后收取病毒液，将传染性法氏囊病毒接种df-1细胞后收取病毒液，将禽腺病毒ⅰ群血清4型dc株接种lmh细胞后收取病毒液，经甲醛灭活后，将4种病毒液混合后加油佐剂混合乳化制成疫苗。

如上所述的制备方法，优选地，所述甲醛灭活的操作是指在病毒溶液中加入甲醛溶液，所述甲醛在病毒溶液中的终浓度为体积百分比0.2％，37℃灭活16小时，之后置于2～8℃保存。

进一步地，所述4种病毒液混合后的混合液加入含有重量百分比4％的吐温-80作为水相；

所述加油佐剂混合乳化的具体操作为：取2重量份的油佐剂注入乳化罐内，再加入1重量份的所述水相，中速混合后高速乳化，高速乳化过程中加入体积百分比为1％的硫柳汞液，使其终浓度为体积百分比0.01％。

本发明的有益效果在于：

本发明从全国各地临床发生ⅰ群禽腺病毒感染的养殖场分离病毒株，并对其临床流行病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好、与现有流行毒株同源性高的禽腺病毒ⅰ群血清4型dc株。

本发明的一实施例中应用的新型禽腺病毒ⅰ群血清4型dc株与新城疫lasota毒株、传染性法氏囊病毒bjq902毒株、h9亚型禽流感病毒bx13株制备一种新型的四联灭活疫苗。

本发明的一种鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊和禽腺病毒四联疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治四种疾病，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

具体实施方式

本发明筛选出效价高、免疫原性好的h9亚型禽流感毒株(bx13株)，接种于10—11日龄鸡胚中进行培养，收获含病毒的尿囊液灭活；采用新城疫病毒lasota株，接种于鸡胚培养，收获尿囊液灭活；将传染性法氏囊病毒bjq902株接种于df-1细胞，收获病毒液灭活；将筛选出的效价高、免疫原性好的ⅰ群4型禽腺病毒毒株dc株接种lmh细胞后收取病毒液，经甲醛溶液灭活，将四种灭活抗原按一定比例混合，加入油佐剂，制备了新型的鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊和禽腺病毒四联疫苗。

下面结合实施例详细介绍本发明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明权利要求书的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1制苗用抗原毒株(ⅰ禽腺病毒ⅰ群血清4dc株)的筛选

2015年从河北大厂某养鸡场病死鸡(剖检表现为肝脏肿大、坏死，心包大量黄色积液)取肝脏病料，经研磨匀浆、离心、过滤后以卵黄囊途径接种6日龄spf鸡胚，进行病毒分离。病料接种鸡胚后96h鸡胚全部死亡，鸡胚胚体发育不良、充血出血、肝脏花斑坏死等病变，收获死胚按1:3加生理盐水研磨匀浆，制成病毒悬液。该病毒悬液继续在鸡胚上传代2次，再接种lmh细胞适应3代，得到适应lmh细胞生长的分离毒株，收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^7.5tcid50/0.1ml，该病毒仅与禽腺病毒ⅰ群血清4型发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。

对该毒株进行了鉴定，结果表明，该分离毒株不能凝集鸡红细胞，budr能抑制该毒株复制，病毒核酸类型为dna，对乙醚和氯仿有抵抗力，无脂质囊膜，该病毒株对热敏感，耐酸，不耐碱；经pcr检测和基因序列分析，确定该分离毒为ⅰ群禽腺病毒血清4型；动物回归试验，该分离毒株可引起21、42日龄spf鸡产生与ⅰ群4型禽腺病毒感染相同的临床症状和病理变化。根据试验结果，将该毒株定名为a/chicken/hebei/dc/2015株(fadvdc株)，简称dc株。

将筛选的dc株于2018年04月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，菌株名称为禽腺病毒ⅰ群血清4型dc株(a/chicken/hebei/dc/2015株)，保藏编号为：cgmccno.15589。

实施例2鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊和禽腺病毒四联疫苗的制备及检验

1.制苗用抗原液的制备

1.1禽流感(h9亚型)抗原液的制备

1.1.1禽流感(h9亚型)bx13株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所于2013年从北京某发生h9亚型禽流感的病鸡群中分离并保藏，经过系统的鉴定证明为h9n2亚型禽流感病毒。病毒的繁殖取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3至10^-5稀释)，每胚尿囊腔内接种0.1ml，密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。孵育和观察接种后48小时内，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，将死亡的鸡胚随时取出，直至120小时。120小时后鸡胚无论死亡与否，将全部鸡胚取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。

1.1.2收获将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液，对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，分别取样进行检验，-25℃以下保存备用。

1.1.3检验收获的病毒液，应逐瓶作无菌检验及红细胞凝集试验，并抽样一份测定病毒含量(eid50)，应无菌生长，对1％鸡红细胞悬液凝集价应不低于1:256，每0.1ml病毒含量应≥10^8.0eid50。

1.2新城疫(ndv)lasota株病毒液的制备

1.2.1接种用灭菌生理盐水将生产用毒种ndvlasota株病毒，(购自中国兽医药品监察所)作适当稀释(如10^-2至10^-4稀释)，每胚尿囊腔内接种0.1ml，密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。孵育和观察接种后48小时内，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，将死亡的鸡胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，将全部鸡胚取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。

1.2.2收获将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，分别取样进行检验，-25℃以下保存备用。

1.2.3检验收获的病毒液，应逐瓶作无菌检验及红细胞凝集试验，并抽样一份测定病毒含量(eid50)，应无菌生长，对1％鸡红细胞悬液凝集价应不低于1:512，每0.1ml病毒液ndv含量应≥10^8.0eid50。

1.3鸡传染性法氏囊病bjq902株病毒液的制备

1.3.1df-1细胞的制备

从液氮罐中取出df-1细胞种子复苏，等长满细胞单层后，弃去细胞培养液，加入细胞培养液1/10左右量的0.25％胰蛋白酶漂洗一次，再加入适量的0.25％胰蛋白酶消化，待细胞层出现明显裂痕时弃去胰蛋白酶液，轻晃细胞瓶使细胞全部脱落，加入含5％胎牛血清的dmem培养液，轻晃培养瓶使细胞分散均匀，然后，df-1细胞按1:3-1:5比例传代。

1.3.2接种与培养

待细胞长满单层后(48～72小时)，弃去细胞培养液。取生产用毒种鸡传染性法氏囊病bjq902株病毒，(bjq902株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所于1990年从北京军区养鸡场爆发ibd的鸡场分离并保藏于北京市农林科学院畜牧兽医研究，经spf鸡胚及鸡胚成纤维细胞传代适应，培育出了制苗用bjq902株细胞适应毒。)按体积比为1/5000的量加入到含2％胎牛血清的dmem培养液中，然后，将含毒dmem培养液加入到长满单层的df-1细胞培养瓶中。37℃5％co2条件下培养。

1.3.3收获

接毒后60～72小时，待细胞病变(呈圆形，折光性强，均匀分布，细胞间隙加大，培养液内有大量脱落的圆球形细胞)率达90％以上时收获细胞液，将细胞培养瓶冻存，经两次冻融后装于灭菌容器内，留样并作检验。

1.3.4检验

将经三次冻融后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录作无菌检验及病毒含量测定，应无菌生长，病毒含量应≥10^7.5tcld50/0.1ml。

1.4fadvdc株病毒液的制备

1.4.1lmh细胞的制备

从液氮罐中取出lmh细胞种子复苏，等长满细胞单层后，弃去细胞培养液，加入细胞培养液1/10左右量的0.25％胰蛋白酶漂洗一次，再加入适量的0.25％胰蛋白酶消化，待细胞层出现明显裂痕时弃去胰蛋白酶液，轻晃细胞瓶使细胞全部脱落，加入含10％胎牛血清的dmem培养液，轻晃培养瓶使细胞分散均匀，然后，lmh细胞按1:3-1:5比例传代。

1.4.2接种与培养

待细胞长满单层后(48～72小时)，弃去细胞培养液。取生产用毒种(实施例1中制备的)，按体积比为1/100的量加入到含2％胎牛血清的dmem培养液中，然后，将含毒dmem培养液加入到长满单层的lmh细胞培养瓶中。37℃5％co2条件下培养。

1.4.3观察与收获

接毒后每日观察2次，记录细胞病变情况，当细胞病变(呈圆形，折光性强，均匀分布，细胞间隙加大等)率达90％以上时收获细胞液，将细胞培养瓶冻存，经两次冻融后装于灭菌容器内，留样并作检验。

1.4.4检验

将经三次冻融后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录作无菌检验及病毒含量测定，应无菌生长，每0.1ml病毒液fadv含量应病毒含量应≥10^7.0tcld50。

1.5病毒液的浓缩和灭活

1.5.1病毒液的浓缩

将ndv、aiv、ibdv及fadv毒液采用管式分离机，对病毒抗原液进行浓缩前处理，除去毒液中的大颗粒杂质，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统分别将这4种病毒液浓缩至原体积的1/6。

1.5.2病毒灭活

将检验合格的浓缩的ndv、aiv、ibdv及fadv病毒液，分别加入10％甲醛溶液，使其甲醛溶液的终浓度均为体积百分比0.2％，边加边搅拌，使其充分混合，37℃条件下灭活(从抗原液温度升至37℃开始计时)，灭活16小时。灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过30日。

1.6半成品检验

1.6.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录，分别对浓缩及灭活后的ndv、aiv、ibdv及fadv病毒液进行无菌检验，应无菌生长。

1.6.2病毒含量测定

1.6.2.1ndv浓缩病毒液

取灭活前的浓缩病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行测定，浓缩病毒液ha比浓缩前病毒原液高6倍，即应≥1:3072(6×512)。

或将灭活前的浓缩液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄spf鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128者判为感染，计算eid50。每0.1ml应≥6×10^8.0eid50。

1.6.2.2h9亚型aiv浓缩病毒液

取灭活前的浓缩病毒液，均按1.6.2.1进行红细胞凝集价测定，浓缩病毒液ha比浓缩前病毒原液高6倍，即应≥1:1536(6×256)，或将灭活前的浓缩液按1.6.2.1测定病毒含量，每0.1ml应≥6×10^8.0eid50。

1.6.2.3ibdv浓缩病毒液

将灭活前的浓缩病毒液，用dmem培养基作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，分别接种已长成单层的cef细胞各5孔，每孔0.1ml，置37℃5％co2培养，观察120小时，根据细胞病变情况，计算tcid50。每0.1ml病毒液ibdv含量应≥10^7.5tcid50。

1.6.2.4fadv浓缩病毒液

将灭活前的浓缩病毒液，用dmem培养基作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，分别接种已长成单层的lmh细胞各5孔，每孔0.1ml，置37℃5％co2培养，观察192小时，根据细胞病变情况，计算tcid50。每0.1ml病毒液fadv含量应≥10^7.0tcid50。

1.6.3灭活检验

1.6.3.1ndv灭活检验

取灭活后的浓缩病毒原液，尿囊腔内接种9～11日龄spf鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行ha试验，应全部为阴性。

1.6.3.2h9亚型aiv灭活检验

取灭活后的浓缩病毒原液，尿囊腔内接种9～11日龄spf鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行ha试验，应全部为阴性。

1.6.3.3ibdv灭活检验

取灭活后的浓缩病毒原液，经绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄spf鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，定期照蛋，剔除接种后24小时内的死胚(鸡胚非特异性死亡应不超过2枚)，及时取出24～168小时内的死胚，至168小时，将鸡胚全部取出，观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。收获所有鸡胚的尿囊膜，经匀浆后取上清，再接种10～12日龄spf鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育168小时后(剔除接种后24小时内的死胚)，将鸡胚全部取出，观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。

1.6.3.4fadv灭活检验将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种t25细胞培养瓶(单层lmh细胞)4瓶，同时设未接种的细胞1瓶作对照，置37℃5％二氧化碳培养箱培养，观察192小时，细胞对照及样品均应不出现病变。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养192小时，样品培养瓶仍不出现细胞病变时，判定灭活完全。

实施例3

一、油佐剂灭活疫苗的制备

1.油相制备

取注射用白油94重量份，加2％(重量比)的硬脂酸铝，加热，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-806重量份，混合后，高压灭菌备用。

2.水相制备

将浓缩灭活的ndv、aiv、ibdv及fadv病毒液以适当比例(1：1：3：1)混合，使每羽份终产品中的ndv抗原含量≥10^8.2eid50、aiv抗原含量≥10^8.2eid50、ibdv抗原含量≥10^8.2tcid50、fadv抗原含量≥10^7.2tcid50取混合后的抗原液96重量份，加入灭菌的吐温-804重量份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解。

3.乳化

将重量2份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化，即2900转/分钟，40—60分钟。在乳化终止前加入体积百分比为1％的硫柳汞液，使其终浓度为体积百分比为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3500r/min离心15分钟，应不出现分层。

4.分装

定量分装，加盖密封。贴标签，置2～8℃保存。

二、疫苗成品检验

1.性状

1.1.外观白色均匀乳剂。

1.2.剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

1.3.稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3500r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0.5ml。

1.4.黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.安全检验用3～5周龄spf鸡10只，每只颈背部皮下或胸部肌肉注射疫苗1.0ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。

5.效力检验

5.1鸡新城疫部分

5.1.1.采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行。

5.1.2.血清学方法用3～5周龄spf鸡15只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗20ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》附录进行hi抗体效价测定。免疫组鸡hi抗体效价的几何平均值应不低于1:16，未免疫对照组鸡hi抗体效价均应不高于1:4。

5.1.3.免疫攻毒法用3～5周龄spf鸡15只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗20ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株(cvccav1611株)10⁵eld50，观察14日，对照组鸡应全部死亡，免疫组鸡应至少保护7只。

5.2.禽流感部分

5.2.1.采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行。

5.2.2.血清学方法用3～5周龄spf鸡15只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3m1，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽流感病毒h9亚型抗原测定hi抗体(见附注1)。免疫组鸡hi抗体效价的几何平均值应不低于1:90，未免疫对照组鸡hi抗体效价均应不高于1:4。

5.2.3.免疫攻毒法用3～5周龄spf鸡15只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3m1，另5只作对照。接种后21～28日，用稀释的h9亚型aivbx13株毒种(病毒含量10^7.4eid50)进行翅静脉注射，每只鸡0.5m1。攻毒后第3日，分别采集每只鸡的泄殖腔及气管拭子，将同一只鸡的泄殖腔及气管拭子混合后作为1个样品，每个样品经尿囊腔接种9～11日龄spf鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，逐胚测定鸡胚液的ha效价。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液ha效价不低于1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。免疫组鸡应至少有9只鸡病毒分离阴性，对照组鸡应至少有4只鸡病毒分离阳性。

5.3.传染性法氏囊病部分

5.3.1.采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行。

5.3.2.血清学方法用21日龄spf鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.5ml，另5只作对照。接种28日后，每只鸡各采血，分离血清，测定鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体(见附注2)。对照鸡平均中和抗体效价应不高于1:8，免疫鸡平均中和抗体效价应不低于1:10000。

5.3.3.免疫攻毒法用21日龄spf鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.5ml，另5只作对照。接种28日后，用鸡传染性法氏囊病bjq902株强毒攻击，每只点眼、口服0.2ml(含10^5.0bid50)，72小时后全部剖杀，检查法氏囊，对照组鸡应至少有4只出现法氏囊病变，免疫组鸡应至少有9只法氏囊正常。

5.4.ⅰ群4型禽腺病毒部分

5.4.1.采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行。

5.4.2.血清学方法用3～4周龄spf鸡20只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，每只鸡各采血，分离血清，测定ⅰ群4型禽腺病毒中和抗体(见附注3)。对照鸡平均中和抗体效价应不高于1:2，免疫鸡平均中和抗体效价应不低于1:16。

5.4.3.免疫攻毒法用3～4周龄spf鸡20只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，所有试验鸡用ⅰ群4型禽腺病毒dc株攻击，每只肌肉注射稀释的fadvdc株0.1ml(病毒含量106.0tcid50)，观察7天。对照组鸡应至少9只发病(出现精神沉郁、缩颈、羽毛逆立、拉绿色粪便等，严重者死亡；剖检出现心包积液、肝脏肿大坏死、肾脏肿大等病变)，免疫组鸡至少保护9只(无临床症状及剖检病变)。

6.甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。

实施例4

对流行毒株的攻毒保护

采用实施例3制备的鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(ⅰ群，4型dc株)四联灭活疫苗(lasota株+bx13株+bjq902株+dc株)(简称新流法腺四联苗)免疫spf鸡，免疫后4周采血，检测nd中和抗体效价，然后用新城疫强毒北京株f48e9株(购自中国兽医药品检查所)，进行攻毒试验。结果如表1所示，免疫组nd中和抗体效价达10.2log2，攻毒后均10/10保护，对照组鸡均0/5保护，由此可见，新流法腺四联苗对目前的流行毒株仍具有较好的保护效力。

表1.新流法腺四联苗免疫后对新城疫强毒北京株的免疫保护效果

采用实施例3制备的鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(ⅰ群，4型)四联灭活疫苗(lasota株+bx13株+bjq902株+dc株)免疫spf鸡，免疫后采血测定禽流感(h9亚型)hi抗体，然后分别用h9亚型禽流感病毒bx13株、2013年-2017年h9亚型禽流感病毒分离株(sm13株、bz13株、zc14株、dx15株、bz15株、jh16株、pg16株及bd17株，是由北京市农林科学院畜牧兽医研究所在2013——2017年期间收集自福建三明、山东滨州、山东诸城、天津静海、北京大兴、河北霸州、北京平谷及河北保定，经实验室分离、收集、传代和鉴定。)进行攻击，观察新流法腺四联苗对h9亚型禽流感病毒流行毒株的保护效果。结果如表2显示，四联灭活疫苗免疫后，免疫组鸡hi抗体效价明显上升，达到9.1-9.8log2，而对照组鸡抗体为0；用bx13株、sm13株、bz13株、zc14株、dx15株、bz15株、jh16株、pg16株及bd17株攻毒后，如表3所示，对照组鸡均100％(5/5)分毒阳性，保护率为0，而免疫组鸡8/10至10/10分毒阴性，保护率为80％至100％。试验证明，用2013年分离的bx13株制备出的新流法腺四联苗对目前的流行毒株仍具有较好的保护效力。

表2.新流法腺四联苗免后禽流感(h9亚型)hi试验的结果

表3.新流法腺四联苗免后的禽流感毒株攻毒试验的结果

采用按照实施例3制备的鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(ⅰ群，4型)四联灭活疫苗(lasota株+bx13株+bjq902株+dc株)免疫spf鸡，免疫后4周采血，检测ibd中和抗体效价，然后分别用ibdv标准毒株bc6/85株(购自中国兽医药品监察所)及近期国内流行的2个超强毒株，即hby株囊毒由中国兽医药品监察所蒋桃珍主任惠赠，sc14株囊毒由山东信得科技股份有限公司惠赠，进行攻毒试验。结果如表4所示，免疫组ibd中和抗体效价达15.6至16.0log2，攻毒后均10/10保护，对照组鸡均0/5保护，由此可见，bjq902株对标准毒株bc6/85株及近期国内流行的超强毒株具有良好的免疫保护效果。

表4.对ibdvbc6/85株及近期流行的超强毒株的免疫保护效果

采用鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(ⅰ群，4型)四联灭活疫苗(lasota株+bx13株+bjq902株+dc株)免疫spf鸡，免疫后采血测定fadv中和抗体，然后分别用fadvdc株、2015年-2017年分离的5个fadv分离株(zb2016株、zd2015株、sc2016株、dt1-2017株和dt2-2017株)进行攻击，观察新流法腺四联苗对fadv病毒流行毒株的保护效果。结果如表5所示，新流法腺四联苗免疫后，免疫组鸡fadv中和抗体效价明显上升，达到9.6-10.1log2，而对照组鸡抗体为0；用dc株、zb2016株、zd2015株、sc2016株、dt1-2017株和dt2-2017株攻毒后，结果如表6所示，对照组鸡9/10到10/10发病，而免疫组鸡均10/10保护，保护率均100％。试验证明，用dc株制备出的新流法腺四联苗对目前的流行毒株仍具有较好的保护效力。

表5.新流法腺四联苗免后fadv中和抗体测定结果

表6.新流法腺四联苗免后对禽腺病毒攻毒试验的结果

附注1

1.2h9亚型禽流感hi试验操作术式

1.2.1取96孔v型微量反应板，分别向1～11孔中加入25μlpbs(1/15mol/l，ph7.2)，第12孔中加入50μl生理盐水。

1.2.2吸取25μl血清，加至第1孔内，充分混匀后，吸取25μl至第2孔，依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μl，弃去。

1.2.3分别向1～11孔中加入含4ha单位的抗原25μl，室温下静置30分钟。

1.2.4每孔中加入25μl1％(v/v)鸡红细胞悬液，轻轻混匀，室温下静置30分钟。对照红细胞将呈显著纽扣状。

1.2.5结果判定将反应板倾斜后判定结果。当阴性对照血清hi效价不高于1:4、阳性对照血清hi效价与已知结果相比，误差不超过1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制4ha单位抗原的血清最高稀释度作为hi效价。

附注2

2鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体测定方法

2.1材料

2.1.1试剂高糖dmem培养基，胎牛血清，0.25％胰蛋白酶溶液，hank’s液。

2.1.2仪器生物安全柜，倒置显微镜，co2培养箱，高压灭菌锅，恒温水浴锅；96孔微量细胞培养板，单道及多道微量移液器，吸头，2mleppendorf离心管，加样容器，吸管，烧杯等。

2.1.3ibdv中和试验抗原、阳性血清与阴性血清，ibdv中和试验抗原为本研究室制备的ibdvbjq902株cef细胞适应毒毒种，病毒含量≥10^7.5tcid50/ml；阳性血清由本研究室用ibd疫苗免疫spf鸡，取免疫鸡血，分离血清制备而成，已测定中和抗体效价；阴性血清采自spf鸡血，分离血清制备而成，中和抗体效价不高于1:8。

2.1.4被检血清采集试验鸡血，分离血清，保存于-28℃冰箱。试验前待检血清要进行灭活处理，在56℃水浴灭活30分钟，待冷却后使用。

2.2中和抗体测定方法

2.2.1鸡胚成纤维细胞的制备取9～11日龄发育良好的spf鸡胚，用强力碘(原液)消毒卵壳。以无菌手术取出胎儿，去眼、脑、四肢、内脏放入消毒管内，剪成约lmm3的小块，用hank’s液清洗两次，再加入与鸡胚悬液等体积的0.25％胰蛋白酶溶液(ph7.2)，在38℃水浴消化6～8分钟，吸出胰蛋白酶溶液，用hank’s液清洗两次，再用dmem液清洗一次后，吹打分散细胞，加适量dmem液，沉淀后用8层纱布过滤，细胞计数后加入含10％胎牛血清的dmem液，使cef细胞悬液每毫升含细胞数70～80万。

2.2.2细胞培养在96孔细胞培养板各孔中加入cef细胞液0.10ml(7～8万/孔)，置37℃、5％co2培养箱培养24小时，待细胞长成单层。

2.2.3ibdv抗原毒价测定毒价测定采用微量滴定法。首先，将长满cef细胞单层的培养板弃去上清液，每孔加入0.10ml含2％胎牛血清的dmem培养液；在2mleppendorf管中加入0.90mldmem液，将病毒作10倍系列稀释，从1:10¹、1:10²、1:10³……稀释到1:10⁹，病毒稀释完后，取1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸和1:10⁹四个稀释度，从1:10⁹至1:10⁶方向将病毒稀释液分别加入cef细胞孔中，每孔加入0.10ml，每个稀释度接种5孔，1个稀释度1个吸头。试验时设置cef细胞正常对照及病毒对照。将细胞培养板振荡30秒，放37℃、5％co2温箱培养，观察5天，按karber法计算tcid50。

2.2.4中和抗体测定血清中和抗体测定采用微量滴定法。用两套96孔微量细胞培养板，一套用于血清与病毒作用，另一套用于中和抗体测定。

2.2.4.1血清稀释在96孔微量细胞培养板(第一套板)加入dmem液，每孔加0.05ml，取待检灭活血清0.05ml加入到第一孔内，充分混匀后取0.05ml加入到第二孔内，进行2倍系列稀释，从1:2¹、1:2²、1:2³……稀释到1:2²⁴。

2.2.4.2ibdv工作抗原的配制根据ibdv抗原毒价测定结果，计算工作抗原配制所需抗原稀释倍数，用dmem液将抗原稀释成200tcid50/0.025ml，配完后尽快使用。

2.2.4.3血清中和血清稀释完后，从1:224至1:21方向分别在上述各孔内加0.05ml(即与血清等体积)的病毒悬液(滴度为200tcid50/0.025ml)，充分振荡混合，放37℃、5％co2温箱作用1小时。

2.2.4.4移板将长满cef细胞单层的培养板(第二套板)弃去上清液，每孔加入0.15ml含2％胎牛血清的dmem培养液；从1:2¹至1:2²⁴方向将第一块板每孔0.05ml病毒中和液移入第二套板相应孔内，1个样品1个吸头。将细胞培养板振荡30秒。试验时设置cef细胞正常对照、阴性血清对照、阳性血清对照及病毒对照。

2.2.4.5培养放37℃、5％co2温箱培养，观察5天。

2.2.4.6判定当病毒对照孔全部出现病变，细胞对照呈现良好单层，阳性血清中和抗体滴度在已知范围内，阴性血清中和抗体滴度不高于1:8，试验结果成立。以完全抑制细胞出现病变的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价。

附注3

3ⅰ群4型禽腺病毒中和抗体测定方法

3.1材料

3.1.1试剂高糖dmem培养基，胎牛血清，0.25％胰蛋白酶溶液，hank’s液。

3.1.2仪器生物安全柜，倒置显微镜，co2培养箱，高压灭菌锅，恒温水浴锅；96孔微量细胞培养板，单道及多道微量移液器，吸头，2ml离心管，加样容器，吸管，烧杯等。

3.1.3fadv中和试验抗原、阳性血清与阴性血清，fadv中和试验抗原为本研究室制备的fadvdc株lmh细胞适应毒毒种，病毒含量≥10^8.0tcid50/ml；阳性血清由本研究室用fadvdc株免疫spf鸡，取免疫鸡血，分离血清制备而成，已测定中和抗体效价；阴性血清采自spf鸡血，分离血清制备而成，中和抗体效价不高于1:2。

3.1.4被检血清采集试验鸡血，分离血清，保存于-28℃冰箱。试验前待检血清要进行灭活处理，在56℃水浴灭活30分钟，待冷却后使用。

3.2中和抗体测定方法

3.2.1细胞培养在96孔细胞培养板各孔中加入lmh细胞液0.10ml(1.5万/孔)，置37℃、5％co2培养箱培养24小时，待细胞长成单层。

3.2.2fadv抗原毒价测定毒价测定采用微量滴定法。首先，将长满lmh细胞单层的培养板弃去上清液，每孔加入0.10ml含2％胎牛血清的dmem培养液；在2mleppendorf管中加入0.90mldmem液，将病毒作10倍系列稀释，从1:10¹、1:10²、1:10³……稀释到1:10⁹，病毒稀释完后，取1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸和1:10⁹四个稀释度，从1:10⁹至1:10⁶方向将病毒稀释液分别加入lmh细胞孔中，每孔加入0.10ml，每个稀释度接种5孔，1个稀释度1个吸头。试验时设置lmh细胞正常对照及病毒对照。放37℃、5％co2温箱培养，观察8天，按karber法计算tcid50。

3.2.3中和抗体测定血清中和抗体测定采用微量滴定法。用两套96孔微量细胞培养板，一套用于血清与病毒作用，另一套用于中和抗体测定。

3.2.3.1血清稀释在96孔微量细胞培养板(第一套板)加入dmem液，每孔加0.05ml，取待检灭活血清0.05ml加入到第一孔内，充分混匀后取0.05ml加入到第二孔内，进行2倍系列稀释，从1:2¹、1:2²、1:2³……稀释到1:2²⁴。

3.2.3.2fadv工作抗原的配制根据fadv抗原毒价测定结果，计算工作抗原配制所需抗原稀释倍数，用dmem液将抗原稀释成200tcid50/0.025ml，配完后尽快使用。

3.2.3.3血清中和血清稀释完后，从1:224至1:21方向分别在上述各孔内加0.05ml(即与血清等体积)的病毒悬液(滴度为200tcid50/0.025ml)，充分振荡混合，放37℃、5％co2温箱作用1小时。

3.2.3.4移板将长满lmh细胞单层的培养板(第二套板)弃去上清液，每孔加入0.15ml含2％胎牛血清的dmem培养液；从1:2¹至1:2²⁴方向将第一块板每孔0.05ml病毒中和液移入第二套板相应孔内，1个样品1个吸头。试验时设置lmh细胞正常对照、阴性血清对照、阳性血清对照及病毒对照。

3.2.3.5培养放37℃、5％co2温箱培养，观察8天。

3.2.3.6判定当病毒对照孔全部出现病变，细胞对照呈现良好单层，阳性血清中和抗体滴度在已知范围内，阴性血清中和抗体滴度不高于1:2，试验结果成立。以完全抑制细胞出现病变的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价。