Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及ph+急性b淋巴细胞白血病的疾病模型及其kqbl-84细胞株的构建方法和应用。

背景技术

急性b细胞淋巴白血病(b-all)是一种常见的起源于b淋巴细胞系在骨髓内异常增生的恶性血液肿瘤，其在儿童白血病中所占比例为70％以上，而在成人白血病中所占比例约为20％。异常增生的幼稚b细胞在骨髓大量聚集会抑制正常造血功能，同时也可侵犯骨髓外的组织，如外周血、脾脏、淋巴结、性腺、肝等。

随着干细胞移植技术的成熟，以及酪氨酸激酶抑制剂(tki)等靶向药物的应用，急性淋巴细胞白血病的治疗效果发生了很大改变，其缓解率和长期生存率都有了明显提高。但是对于难治/复发急性b淋巴细胞白血病仍缺乏有效治疗手段，预后仍较差。

白血病细胞株可进行分子遗传学研究、构建动物模型进行研究，能够深入地探索白血病发生、发展和转归的机制，辅助临床早期诊断、治疗并进行药物筛选，有重要的临床和研究价值。然而现有技术中利用白血病细胞株进行动物模型构建时，往往存在针对性差、恶性程度较低、建模速度慢及建模成本高等问题。

根据研究发现，在b-all中，费城染色体阳(ph+)性的b-all约占15-20％，患者具有基因易位(表现为bcr/abl基因融合)这一生物学特性。针对ph+的b-all，本申请研制了一种急性b淋巴细胞白血病kqbl-84细胞株及其构建方法和应用，既可用于难治/复发型b-all发病机理的研究，又可以用于临床前评价治疗该疾病的药物或治疗新方法。

技术实现要素：

针对以上存在的技术问题，本发明提供ph+急性b淋巴细胞白血病kqbl-84细胞株及其构建方法和应用。

本发明的技术方案：一种急性b淋巴细胞白血病kqbl-84细胞株，其由携带人融合基因bcr-abl的mscv-p210逆转录病毒感染c57bl/6供体小鼠的骨髓细胞，而获得稳定表达bcr-abl人原癌基因的原代细胞系，经筛选和培养，获得高致癌性且可稳定遗传的前体b细胞系。

本发明还提供了一种ph+急性b淋巴细胞白血病kqbl-84细胞株的构建方法，包括以下步骤：

步骤a：从供体c57bl/6鼠中获取正常的骨髓细胞；

步骤b：利用携带人bcr-abl融合基因的mscv-p210逆转录病毒感染液感染步骤a中获取的骨髓细胞，获得感染后的骨髓细胞；

步骤c：将正常受体c57bl/6鼠进行致死性剂量γ辐照处理；

步骤d：将步骤b获得的感染后的骨髓细胞经尾静脉注入受体小鼠体内，得到发病小鼠；

步骤e：筛选步骤d处理后的发病小鼠中发病严重且伴有胸水的小鼠，并进行流式和病理鉴定；

步骤f：分离步骤e鉴定成功的发病小鼠的胸水；

步骤g：将步骤f分离得到的胸水经细胞裂解液裂解，收集细胞，再经体外培养筛选后，得到可稳定遗传的细胞株，即kqbl-84细胞株。

进一步地，步骤a中的所述骨髓细胞总数不少于5×10⁷个，骨髓细胞总数过少会影响实验的顺利进行。

进一步地，步骤b中的所述感染液包括：mscv-p210病毒49-50wt％、fbs7.0-7.5wt％、wehi4.5-5.0wt％、100x，1m，ph＝7.4的hepes0.9-1.0wt％、100×pencilin/strep0.9-1.0wt％、500×1mg/mlpolybrene0.15-0.2wt％、1000×1mg/mlciprofloxacin0.09-0.10wt％。

更进一步地，步骤b进一步包括以下步骤：

步骤b1：取4ml所述感染液重悬细胞，并转移至6孔板中；

步骤b2：37℃，1000g，水平转子离心90min；

步骤b3：放置细胞培养箱，37℃，5％co2，4h；

步骤b4：收集步骤b3处理后的细胞至50ml离心管中，并且用2mlpbs润洗细胞培养皿，并将残余的细胞一并进行收集到离心管中；

步骤b5：300g，离心10min，去除上清液，用5-10mlpbs重悬细胞，得到感染后的骨髓细胞悬液，并且进行细胞计数，根据细胞总数，将细胞密度调整至5×10⁶个/ml。

进一步地，步骤c中所述处理正常受体小鼠的辐照处理方法为：采用11gyγ-ray的致死照射剂量分两次对受体小鼠进行照射，每次5.5gy，中间隔3h。低于11gy照射剂量不够会影响小鼠发病率，而高于11gy照射剂量则会提高小鼠的死亡率。

进一步地，步骤d中的所述受体小鼠处理方法为：用1ml医用注射器，通过尾静脉向每只正常受体小鼠体内注射200μl所述感染后的骨髓细胞悬液。

进一步地，步骤g进一步包括：鉴定成功后，取b-all发病严重的小鼠的胸水，用10ml红细胞裂解液(rbc)冰上裂解10min，pbs清洗3次，用rpmi1640(10％fbs)加50μm的β-巯基乙醇培养一个月，得到可稳定遗传的kqbl-84细胞株。

本发明还提供了所述kqbl-84细胞株的三种应用，分别为：(1)用于制造原发性b-all肿瘤小鼠模型。(2)用于费城染色体阳性(ph+)这部分急性b淋巴细胞白血病发病机理的研究。(3)所述kqbl-84细胞用于化疗耐受和靶向药物耐药这部分难治/复发急性b淋巴细胞白血病的治疗新方法临床前评价，例如用于针对靶点cd19的car-t细胞治疗的体内评价，针对血液肿瘤开发各种新药临床前评价。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的细胞株是由携带人bcr-abl融合基因的mscv-p210逆转录病毒载体感染供体c57bl/6鼠的骨髓细胞，获得稳定表达bcr-abl基因的原代细胞系，再将该原代细胞注入受体c57bl/6鼠体内，经筛选和培养，获得高致癌性且可稳定遗传的前体b细胞系。可用于构建原发b-all小鼠模型，且该模型的恶性程度较高，成模速度快，建模成本低，适合用于难治/复发型b-all的治疗评价及费城染色体阳性(ph+)这部分b-all发病机理的研究。

附图说明

图1为本发明的整体流程图及发病小鼠筛选鉴定结果示意图；

图2为本发明的kqbl-84细胞株的b220抗原表达图；

图3为本发明实施例2中受体小鼠的外周血(pb)、脾脏(spleen)、骨髓(bm)中流式分析结果图；

图4本发明实施例3中感染后的受体小鼠经靶向药物治疗的耐药测试结果图。

急性b淋巴细胞白血病kqbl-84细胞株，保藏编号：cctccno:c2018164，保藏日期：2018年7月25日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

具体实施方式

本发明结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。

下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。

实施例1

(ⅰ)从供体小鼠中收集骨髓细胞

1)选取6周龄，体重在24-26g之间的健康c57bl/6小鼠作为供体小鼠，用co2处死供体小鼠；

2)在超净台中，用70％消毒酒精对处死后的供体小鼠腹部进行消毒；

3)取供体小鼠两侧的股骨，胫骨，髋骨放在预冷的293t细胞培养基中，293t细胞培养基的配比为dmem+10％fbs+1％谷氨酰胺+1％双抗+1％非必须氨基酸；

4)用10ml注射器吸取足量的293t培养基，用27g1/2针头把骨髓腔中的骨髓细胞冲到50ml离心管中，快速有力上下颠倒充分使得骨髓细胞分成单细胞；

5)用10ml移液管把所有的细胞收集在一个管子中，并且用100μm无菌滤网过滤，去除残渣；

6)取10μl细胞悬液，用40μl预冷的rbc裂解液，冰上裂解5min，用2×台盼蓝染色计算其中的骨髓细胞数，每只供体小鼠的骨髓细胞总数不少于5×10⁷；

7)在4℃，300g条件下，离心10min收集供体小鼠的骨髓细胞。

(ⅱ)利用病毒感染骨髓细胞

1)取4mlmscv-ires-gfp-bcr/abl病毒(简称mscv-p210)感染液重悬上述骨髓细胞，并转移至6孔板中；p210病毒感染液的配比如表1所示；

表1：p210病毒感染液

2)将重悬的骨髓细胞在37℃，1000g条件下，离心90min；

3)离心完细胞聚集在孔板一侧，用枪尖轻轻吹起细胞至松散，然后放置到细胞培养箱，在37℃，5％co2条件下培养4h；

4)收集培养后的细胞至50ml离心管中，并且用2mlpbs润洗细胞培养皿，并将残余的细胞一并进行收集到离心管中；

5)300g，离心10min；

6)去除上清液，用5-10mlpbs重悬细胞，得到感染后的骨髓细胞悬液，取10μl细胞悬液，用40μl预冷的rbc裂解液，冰上裂解10min，用2×台盼蓝染色计算其中感染后的骨髓细胞数量；

7)300g，离心10min；

8)根据细胞总数，将感染后的骨髓细胞密度调整至5×10⁶个/ml。

(ⅲ)获取稳定遗传的细胞株

1)采用11gyγ-ray的致死照射剂量分两次对正常受体小鼠进行照射，每次5.5gy，中间隔3h；

2)用1ml医用注射器，通过尾静脉向每只受体小鼠体内注射200μl所述感染后的骨髓细胞悬液；

3)在spf级动物房内继续饲养受体小鼠4-5周待其发病，挑选发病严重伴有胸水的小鼠的外周血(pb)、脾脏(spleen)、骨髓(bm)进行流式和病理鉴定，鉴定结果示意图如图1所示；

4)鉴定成功后，取b-all发病严重的小鼠的胸水，用10ml红细胞裂解液(rbc)冰上裂解10min，pbs清洗3次，用rpmi1640(10％fbs)加50μm的β-巯基乙醇培养一个月，得到可稳定遗传的细胞株(命名为kqbl-84细胞株)，该细胞为ph⁺的b细胞，该细胞的表达结果如图2所示。

实施例2

将实施例1获得的kqbl-84细胞株用于快速构建原发小鼠肿瘤模型。

将2×10⁵的kqbl-84细胞经尾静脉注射到受体c57bl/6小鼠体内，在8-12天内受体小鼠即可表现出难治/复发急性b淋巴细胞白血病表型，其中受体小鼠的外周血(pb)、脾脏(spleen)、骨髓(bm)中检测结果如图3所示。

实施例3

对实施例2感染后的受体小鼠经行靶向药物耐药测试。

设置两个对比组，分别为经靶向抗肿瘤药物dasatinib实验组与vehicle空白试剂组进行测试。测试结果如图4所示，结果表明对此类小鼠进行常规的酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗无效，符合预期。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。