本发明涉及一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，属于医学美容技术领域。
背景技术
在人类预期寿命不断延长，人口日益老龄化的现代社会，衰老与长寿问题倍受各方面的关注，减缓皮肤的衰老已经渐渐成为人们追求的目标。人体的衰老，皱纹的出现，究其根源实质上都是细胞的衰老和减少。而细胞的衰老和减少则是由干细胞老化引起的。
脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)、adsc多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。
同时研究表明干细胞生长因子可以快速激活休眠的干细胞并促使其生长，同时可以调节机体内微环境，为干细胞提供有利的生长条件。生长因子多为广义的肽激素，有表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源增殖因子等。有研究表明该类生长因子在美容方面功能强大，能对受损皮肤、敏感皮肤、创伤皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理，缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成，再生血管，促进胶原蛋白合成，延缓衰老等。
现有的美容保养品，大都通过化工方法制得，其产品中的有害物质残留较多，长期使用会对皮肤产生不利影响。而且现有产品大都不具有生物活性物质，不能够有效促进表皮细胞的新陈代谢，改善皮肤的光泽。而且，化工护肤品中含有的部分物质会对人体产生过敏反应，不适合全体人群使用。因此研发一种对皮肤友好，并且能减缓皮肤衰老的皮肤保养产品，具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，通过脂肪干细胞培养得到细胞液产品，其中的低温冷冻步骤能能够延长保存时间，利用脂肪干细胞分泌各种生长因子，促进皮肤创面再生愈合。具体技术方案如下：
一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获取脂肪干细胞，获取脂肪组织，用d-hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min～3min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比2～4:2～4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液，制成脂肪干细胞液。
作为上述技术方案的改进，在步骤一中，消化液为胰酶和ⅰ型胶原酶按照体积比1:1混合而成，其中胰酶的质量分数为0.25％，ⅰ型胶原酶的质量分数为0.1％。
作为上述技术方案的改进，在步骤一中，离心分离的速度为800rpm～1800rpm，离心时间为5min～15min。
作为上述技术方案的改进，在步骤二中，酶液为质量分数为0.25％的胰酶。
作为上述技术方案的改进，在步骤二中，脂肪干细胞生长的代数为四代或六代。
作为上述技术方案的改进，在步骤三中，低温保护剂为甘油。
作为上述技术方案的改进，在步骤三中，低温冷冻装置的冷冻温度为-40℃～-80℃。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，细胞生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子中的一种或多种。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，细胞生长因子首先与d-hanks缓冲液混合。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，细胞生长因子与d-hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子5mg～20mg和d-hanks缓冲液500ml～1000ml。
上述技术方案具有以下几个优点：
(1)本发明采用生物技术培养脂肪干细胞组织表皮细胞的方法制得干细胞液，产品中均为生物活性物质，不含有化工制造化妆品中含有的重金属等有毒有害物质，确保了产品的使用安全性，不会产生过敏反应；
(2)本发明中脂肪干细胞能够分泌多种细胞生长因子，为皮肤表皮细胞提供良好的微环境，例如纤维母细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素生长因子、血管生长素等，能激活人角质细胞在体外的增殖和迁移，进入促进皮肤再生和皮肤创面愈合，并且可以促进皮肤表皮细胞成熟，增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效；
(3)本发明干细胞液的生产方法，操作简便，生产技术要求不高，适用于大规模生产细胞液产品，能够在生物技术生产车间大规模长时间开展生产过程，制造成本较低，且产品功效很好，并且通过低温冷冻步骤可以延长脂肪干细胞液的保存时间，在需要使用时解除冷冻状态即可，市场前景广阔。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获取脂肪干细胞，获取脂肪组织，用d-hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为800rpm～1800rpm，离心时间为5min～15min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；该步骤中消化液为胰酶和ⅰ型胶原酶按照体积比1:1混合而成，其中胰酶的质量分数为0.25％，ⅰ型胶原酶的质量分数为0.1％；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入酶液消化处理，酶液为质量分数为0.25％的胰酶，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为四代或五代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min～3min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比2～4:2～4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-40℃～-80℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液，制成脂肪干细胞液，该步骤中，细胞生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子中的一种或多种，细胞生长因子与d-hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子5mg～20mg和d-hanks缓冲液500ml～1000ml，细胞生长因子可以通过外加的方式加入到脂肪干细胞液中，同时脂肪干细胞也可以分泌多种细胞生长因子，为皮肤表皮细胞提供良好的微环境。
上述步骤三中，低温冷冻步骤若不加低温保护剂直接冻存细胞，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、ph改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。所以培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。并且在步骤四的细胞复苏阶段，加入保护剂能有助于细胞复苏，减少细胞因低温造成的损伤。同时最终脂肪干细胞液产品中的甘油，在涂抹到皮肤上后，会在皮肤表面形成一层保护膜，将外界空气与皮肤隔离，为皮肤抵挡外界环境带来的侵袭，起到防护的作用。
上述各步骤中，d-hanks缓冲液包括以下组分：氯化钠8.0g/l、氯化钾0.40g/l、一水磷酸氢二钠0.06g/l、磷酸二氢钾0.06g/l、碳酸氢钠0.35g/l、无水葡萄糖1g/l。d-hanks缓冲液配置过程中并未加入钙镁离子，由于钙镁离子对胰酶的活性有抑制作用，钙镁离子可以与胰酶活性部位发生鳌和，使胰酶的活性部位无法暴露，从而影响胰酶的活性。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一
采用以下步骤制备脂肪干细胞液：
步骤一，获取脂肪干细胞，首先获取脂肪组织，脂肪组织可以通过吸脂手术的方式从人体内吸取得到，用d-hanks缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化20min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为800rpm，离心时间为15min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入酶液消化处理，酶液为质量分数为0.25％的胰酶，在脂肪干细胞长到90％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为四代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min～3min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比2:2:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-40℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液，细胞生长因子由表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子混合而成，细胞生长因子与d-hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子10mg和d-hanks缓冲液500ml，最后制成脂肪干细胞液。
实施例二
采用以下步骤制备脂肪干细胞液：
步骤一，获取脂肪干细胞，首先获取脂肪组织，用d-hanks缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化30min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为800rpm，离心时间为15min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入0.25％的胰酶消化处理，在脂肪干细胞长到80％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为四代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比2:2:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-50℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液，细胞生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子混合而成，细胞生长因子与d-hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子20mg和d-hanks缓冲液1000ml，最后制成脂肪干细胞液。
实施例三
采用以下步骤制备脂肪干细胞液：
步骤一，获取脂肪干细胞，首先获取脂肪组织，脂肪组织可以通过吸脂手术的方式从人体内吸取得到，用d-hanks缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化40min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为1000rpm，离心时间为8min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入0.25％的胰酶消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为四代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化3min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比3:3:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-60℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液，细胞生长因子由表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子混合而成，细胞生长因子与d-hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子15mg和d-hanks缓冲液1000ml，最后制成脂肪干细胞液。
实施例四
采用以下步骤制备脂肪干细胞液：
步骤一，获取脂肪干细胞，用d-hanks缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化50min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为1200rpm，离心时间为10min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入酶液消化处理，酶液为质量分数为0.25％的胰酶，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为五代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化2min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比3:3:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-70℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液，细胞生长因子由表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子混合而成，细胞生长因子与d-hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子15mg和d-hanks缓冲液1000ml，最后制成脂肪干细胞液。
实施例五
采用以下步骤制备脂肪干细胞液：
步骤一，获取脂肪干细胞，首先获取脂肪组织，脂肪组织可以通过吸脂手术的方式从人体内吸取得到，用d-hanks缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化50min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为1600rpm，离心时间为5min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入0.25％的胰酶消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为五代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min～3min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比4:4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-80℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中不加入细胞生长因子和d-hanks缓冲液。实验发现，不加入细胞生长因子的脂肪干细胞液也可以起到消除皱纹，减少色斑的效果，但是相对于加入了细胞生长因子的脂肪干细胞液来说，效果稍差。
实施例六
采用以下步骤制备脂肪干细胞液：
步骤一，获取脂肪干细胞，首先获取脂肪组织，脂肪组织可以通过吸脂手术的方式从人体内吸取得到，用d-hanks缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化50min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的dmem培养基中，密封离心分离，离心分离的速度为1600rpm，离心时间为5min，离心分离后去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的dmem培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；
步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入d-hanks缓冲液清洗干净，然后加入0.25％的胰酶消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养，脂肪干细胞生长的代数为五代；
步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用d-hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min～3min，按照脂肪干细胞、dmem培养液、低温保护剂三者的体积百分比4:4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入-80℃低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液，低温保护剂为甘油；
步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，脂肪干细胞随着温度的提高逐步复苏，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中仅加入d-hanks缓冲液，每500ml冷冻干细胞液中加入d-hanks缓冲液1000ml，该实施例与实施例五对照，该步骤中d-hanks缓冲液的加入并不直接影响脂肪干细胞液的美容保养效果。
以上实施例采用在脂肪干细胞液中加入细胞生长因子，同时脂肪干细胞自身也可以分泌多种细胞生长因子，为皮肤表皮细胞提供良好的微环境，能激活人角质细胞在体外的增殖和迁移，进入促进皮肤再生和皮肤创面愈合，并且可以促进皮肤表皮细胞成熟，增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明实施例的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。