一种毛囊干细胞的原代分离方法与流程

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种毛囊干细胞的原代分离方法，尤其是一种人源毛囊干细胞的原代分离方法。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。

毛囊干细胞(hairfolliclestemcells，hfscs)是毛囊中的原始细胞，定位在人的毛囊外根鞘隆突部中、最外层靠近立毛肌附着点处。研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，有效治疗秃发；而且还参与了表皮组织的形成过程。研究hfscs对于秃发的发病机制、毛囊组织工程以及干细胞或基因治疗秃发方面均有重要理论和临床意义。毛囊干细胞具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。

现有的毛囊干细胞分离方法有组织块法(申请号为201310290238.8，发明名称为《大鼠毛囊干细胞的分离培养方法》)和酶消化法(申请号为201310178143.7发明名称为《一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法》)。其中组织块法无法完整的将毛囊从组织中取出，而酶消化法所用胶原酶或胰蛋白酶对组织损伤较大，影响干细胞的培养。而且上述毛囊干细胞的样本来源都是动物，而动物细胞的活性和人体中细胞的活性不同，利用上述方法分离人源毛囊干细胞，细胞生长缓慢、不易贴壁，无法大规模量化生产，并且所用到部分试剂并不适用于临床科研。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效、稳定、便捷的人源毛囊干细胞的原代分离方法，以便分离出大量毛囊干细胞，并能够后续稳定培养。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种毛囊干细胞的原代分离方法，取头皮组织预处理后加中性蛋白酶消化，清洗后顺毛囊生长方向拔出完整的毛囊接种到l-多聚赖氨酸包被的培养瓶中加入培养液培养，待细胞汇合度长至80-90％时传代。

其中，所述预处理为剪去头皮组织外毛发及皮下组织中的脂肪和结缔组织，剪成3～5mm宽的皮条，用氯化钠注射液清洗后置于75％乙醇中清洗，再用氯化钠注射液清洗后剪成细小组织块。

在一些实施方案中，针对新鲜采集的头皮组织，还需要用含双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液4℃保存用于后续的预处理。其中双抗为青链霉素混合液。青霉素-链霉素溶液(100×)中，青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在本发明所述生理盐水及葡萄糖溶液中双抗的浓度优选为1×，即青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

本发明所述分离方法采用中性蛋白酶对头皮组织进行消化。中性蛋白酶与胰蛋白酶相比更加温和，保障了细胞的活力。

其中，作为优选，所述中性蛋白酶的浓度为0.2u/ml-0.5u/ml。在一些实施方案中，所述中性蛋白酶的浓度为0.5u/ml。

作为优选，所述消化为4℃消化9-16h。

作为优选，所述清洗为氯化钠注射液清洗。

本发明所述毛囊干细胞的原代分离方法中采用l-多聚赖氨酸包被培养毛囊干细胞的培养瓶。l-多聚赖氨酸包被的培养瓶更能促进毛囊干细胞的贴壁，使其良好生长。

作为优选，所述包被培养瓶的l-多聚赖氨酸的浓度为20μg/ml-100μg/ml。在一些实施方案中，包被培养瓶的l-多聚赖氨酸的浓度为50μg/ml。

作为优选，所述包被方法为37℃、co2孵育0.5h-4h或4℃、co2孵育9h-16h。在一些实施方案中，所述包被方法37℃、co2孵育2h。

作为优选，所述培养液为瑞士龙沙公司的lonza无血清培养基。

作为优选，所述培养为放入37℃、5％co2浓度的培养箱中培养。

作为优选，所述培养首次换液应间隔72h，之后每1-3天换一次液。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种毛囊干细胞的原代分离方法，取头皮组织预处理后加中性蛋白酶消化，清洗后顺毛囊生长方向拔出完整的毛囊接种到l-多聚赖氨酸包被的培养瓶中加入培养液培养，待细胞汇合度长至80-90％时传代。实验表明本发明所述原代分离方法可分离出大量毛囊干细胞，且细胞活力好，能够后续稳定培养。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1分离的毛囊干细胞显微观察图40×；

图2示实施例1分离的毛囊干细胞显微观察图100×；

图3示实施例1分离的毛囊干细胞细胞流式仪检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种毛囊干细胞的原代分离方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1、毛囊干细胞的原代分离

1.取全层头皮约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，带回实验室24h内操作。

2.剪去头皮外毛发及皮下组织中的脂肪和结缔组织，其后剪成3～5mm宽的皮条，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍。

3.将皮条剪成组织块，置于0.5u/ml的中性蛋白酶4℃消化过夜。

4.12h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍。

5.取一个t25培养瓶，加入1ml100μg/mll-多聚赖氨酸，使其覆盖于整个培养瓶底部，放入37℃二氧化碳培养箱中包被2h后取出。

6.顺毛囊生长方向轻轻拔出完整的毛囊，接种到已包被好的t25培养瓶中。

7.加入5mllonza无血清培养基，放入37℃二氧化碳培养箱中培养，72h后换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。其中分离的毛囊干细胞如图1和图2所示。细胞流式仪检测所得的毛囊干细胞结果为cd73+＞95％、cd90+＞95％、cd34+＜2％、cd45+＜2％(图3)。

实施例2、毛囊干细胞的原代分离

1.取全层头皮约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，带回实验室24h内操作。

2.剪去头皮外毛发及皮下组织中的脂肪和结缔组织，其后剪成3～5mm宽的皮条，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍。

3.将皮条剪成组织块，置于0.2u/ml的中性蛋白酶4℃消化过夜。

4.12h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍。

5.取一个t25培养瓶，加入1ml50μg/mll-多聚赖氨酸，使其覆盖于整个培养瓶底部，放入4℃二氧化碳培养箱中包被2h后取出。

6.顺毛囊生长方向轻轻拔出完整的毛囊，接种到已包被好的t25培养瓶中。

7.加入5mllonza无血清培养基，放入37℃二氧化碳培养箱中培养72h后换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。

实施例3、毛囊干细胞的原代分离

1.取全层头皮约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，带回实验室24h内操作。

2.剪去头皮外毛发及皮下组织中的脂肪和结缔组织，其后剪成3～5mm宽的皮条，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍。

3.将皮条剪成组织块，置于0.3u/ml的中性蛋白酶4℃消化过夜。

4.12h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍。

5.取一个t25培养瓶，加入1ml70μg/mll-多聚赖氨酸，使其覆盖于整个培养瓶底部，放入37℃二氧化碳培养箱中包被2h后取出。

6.顺毛囊生长方向轻轻拔出完整的毛囊，接种到已包被好的t25培养瓶中。

7.加入5mllonza无血清培养基，放入37℃二氧化碳培养箱中培养72h后换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。

实施例4、

1.取全层头皮约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，带回实验室24h内操作。

2.剪去头皮外毛发及皮下组织中的脂肪和结缔组织，其后剪成3～5mm宽的皮条，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍。

3.将皮条剪成组织块，置于0.25％的胰蛋白酶4℃消化过夜。

4.12h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍。

5.取一个t25培养瓶，加入1ml100μg/mll-多聚赖氨酸，使其覆盖于整个培养瓶底部，放入37℃二氧化碳培养箱中包被2h后取出。

6.顺毛囊生长方向轻轻拔出完整的毛囊，接种到已包被好的t25培养瓶中。

7.加入5mllonza无血清培养基，放入37℃二氧化碳培养箱中培养72h后换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。

实施例5、细胞增殖及细胞活率比较

比较分别采用实施例1-4的方法培养7天后的细胞增殖及细胞活率，结果见表1。

表1培养7天后的细胞增殖及细胞活率

由上表可知，使用本发明实施例1-3所述的方法可以在更短的时间内得到更多的高活力的细胞。