增强CIK细胞杀瘤活性的化合物的制作方法

本发明涉及细胞免疫，尤其涉及cik细胞。
背景技术：
cik细胞介导的免疫治疗在提高患者治愈率、减少肿瘤复发、改善患者生活质量、延长生存时间方面可起重要的作用，具有良好的应用前景。提高cik细胞培养效率、增强cik细胞杀瘤活性成为当前研究所急需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供增强cik细胞杀瘤活性的化合物。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：罗默碱在制备增强cik细胞杀瘤活性的试剂或培养基方面的的应用。鹰爪豆碱、白羽扇豆碱、13α-羟基白羽扇豆碱、17-氧代白羽扇豆碱、2-硫代鹰爪豆碱、罗默碱对cik细胞体外培养的影响总结如下：鹰爪豆碱：对cik细胞的增殖能力和杀瘤活性均无明显增强；白羽扇豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；13α-羟基白羽扇豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；17-氧代白羽扇豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；2-硫代鹰爪豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；罗默碱：对cik细胞的增殖能力无明显增强，但可以显著增强cik细胞的杀瘤活性。结合鹰爪豆碱、白羽扇豆碱、13α-羟基白羽扇豆碱、17-氧代白羽扇豆碱、2-硫代鹰爪豆碱的化学结构可以推测这类生物碱的2位氧杂化或硫杂化对活性至关重要。附图说明图1是化合物结构式。图2是培养12天cik细胞体外增殖倍数。图3是培养12天cd3+cd56+表型细胞占比。图4是培养12天cik细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性测定结果。具体实施方式一、实验材料鹰爪豆碱(spartein)、白羽扇豆碱(lupanine)、13α-羟基白羽扇豆碱(13α-hydroxy-lupanine)、17-氧代白羽扇豆碱(17-oxo-lupanine)、2-硫代鹰爪豆碱(2-thionosparteine)、罗默碱(roemerine)自制或购买，纯度不低于98％，化学结构式如图1所示。在无菌条件下，收集健康成年人外周血(肝素抗凝)50ml。淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。rpmi-1640培养基和胎牛血清购自gibco。二、实验方法1、核细胞的分离、分组和cik细胞诱导培养取肝素抗凝的健康成年人外周血50ml，加入淋巴细胞分离液15ml，2000r/min离心30min，分离单个核细胞。用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基调整细胞浓度为1×106/ml，接种于24孔板，每孔930μl。然后按下述进行实验分组：细胞因子组：γ干扰素、白细胞介素1α、白细胞介素2、cd3单抗；细胞因子+生物碱组：用生物碱、γ干扰素、白细胞介素1α、白细胞介素2、cd3单抗；对照组：只用培养液；实验组与对照组均设4个复孔。按分组情况，第1天，细胞因子组、细胞因子+生物碱组加入γ干扰素1000u/ml，细胞因子+生物碱组加入生物碱5μm；培养24h后，细胞因子组、细胞因子+生物碱组加入白细胞介素1α100u/ml、白细胞介素2250u/ml、cd3单抗40ng/ml，细胞因子+生物碱组加入生物碱5μm，继续培养；第4天更换培养基，调整细胞浓度为1×106/ml，细胞因子组、细胞因子+生物碱组补加白细胞介素2250u/ml、cd3单抗40ng/ml，细胞因子+生物碱组补加生物碱5μm；第8天，细胞因子组、细胞因子+生物碱组补加白细胞介素2250u/ml、cd3单抗40ng/ml，细胞因子+生物碱组补加生物碱5μm，继续培养至第12天。2、细胞表型分析及细胞增殖测定各组于培养第12天，用台盼蓝拒染法计数细胞，用流式细胞仪检测cik细胞的比例及细胞表型，并计数cik细胞总数，每组每次各查4个复孔，计算平均值。3、肿瘤杀伤力测定用mtt显色法测定cik细胞杀瘤活性，各组以培养12天的cik细胞为效应细胞，以对数生长期k562细胞为靶细胞，效靶比为15:1。杀瘤活性(％)＝(1－效靶细胞组od值－单独效应细胞组od值)/单独靶细胞组od值×100％4、统计学方法用spss17.0统计软件进行数据统计，计量资料以均值±标准差表示，进行多组数据计量资料单因素方差分析，以p＜0.05为差异有统计意义。三、实验结果1、cik细胞体外增殖及细胞表型分析各组培养至第12天时cik细胞相对于第0天的增殖倍数如表1和图2所示；各组0天和培养至第12天时cd3+cd56+表型细胞的百分比如表1和图3所示。表1cik细胞体外增殖倍数和cd3+cd56+表型细胞占比2、肿瘤杀伤力测定结果各组培养至第12天的cik细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性测定结果如表2和图4所示。表2cik细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性测定结果杀伤活性/％对照组25.97±5.12细胞因子组48.25±5.71细胞因子+鹰爪豆碱组49.18±5.24细胞因子+白羽扇豆碱组72.38±5.68细胞因子+13α-羟基白羽扇豆碱组70.67±5.53细胞因子+17-氧代白羽扇豆碱组68.85±5.19细胞因子+2-硫代鹰爪豆碱组72.19±5.87细胞因子+罗默碱组81.95±5.62鹰爪豆碱、白羽扇豆碱、13α-羟基白羽扇豆碱、17-氧代白羽扇豆碱、2-硫代鹰爪豆碱、罗默碱对cik细胞体外培养的影响总结如下：鹰爪豆碱：对cik细胞的增殖能力和杀瘤活性均无明显增强；白羽扇豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；13α-羟基白羽扇豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；17-氧代白羽扇豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；2-硫代鹰爪豆碱：显著增强cik细胞的增殖能力和杀瘤活性；罗默碱：对cik细胞的增殖能力无明显增强，但可以显著增强cik细胞的杀瘤活性。结合鹰爪豆碱、白羽扇豆碱、13α-羟基白羽扇豆碱、17-氧代白羽扇豆碱、2-硫代鹰爪豆碱的化学结构可以推测这类生物碱的2位氧杂化或硫杂化对活性至关重要。当前第1页12