本发明涉及提取罗汉果籽油及β-谷甾醇的方法，具体涉及一种从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油及β-谷甾醇的方法。
背景技术
罗汉果（siraitiagrosvenorii(swingle)c.jeffrey）是双子叶植物纲（dicotyledoneae）葫芦科（cucurbitaceac）罗汉果属植物的果实，植物学名“光果木鳖”，别名拉江果、假苦瓜，是我国特有的经济、药用植物，主产于广西、广东、湖南、江西等省的热带、亚热带山区，已有200多年的栽培历史。罗汉果味甘性凉，归肺、大肠经，有润肺止咳，生津止渴的功效，适用于肺热或肺燥咳嗽，百日咳及暑热伤津口渴等，此外，还有润肠通便的功效。现代医学研究证实，罗汉果含有一种比蔗糖甜约400倍的天然甜味剂——罗汉果甜苷，但它不产生热量，所以，是糖尿病、肥胖等不宜吃糖者的理想替代饮料。除罗汉果甜苷以外，罗汉果中的营养成分还有大量的低聚果糖、果胶、纤维素、十多种人体必需氨基酸、脂肪酸、β-谷甾醇、黄酮类化合物、维生素c、微量元素等。
据报道，烘干的罗汉果籽中脂肪酸的含量高达40%，其中的主要成分为油酸、亚油酸、和棕榈酸，这几种脂肪酸具有治疗冠心病和预防血管硬化的生理活性，是人体必需的脂肪酸，具有较高的开发价值。
β-谷甾醇属于四环三帖类化合物，其广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中，也存在于某些植物药中。β-谷甾醇具有明显降低血清胆固醇的功效，可以取代胆固醇作为脂质体膜材。β-谷甾醇是一种具有宝贵价值的医药原料和中间体，具有降胆固醇、降血脂、预防心血管疾病、改善前列腺肥大、预防前列腺癌、预防因膳食中胆固醇过高引起的胆囊结石等功效。
目前，从罗汉果籽中提取罗汉果籽油的主要方法有醇提、压榨等。
范云场等公开了一种罗汉果籽油提取的工艺优化，将罗汉果籽经干燥、粉碎、乙醇浸提、离心分离、浓缩、干燥等步骤，得到罗汉果籽油。但是，该方法需要将罗汉果籽干燥，成本高昂，不适合工业化生产。
cn107057829a公开了一种从罗汉果提取渣中分离提纯罗汉果籽油的工艺，是以罗汉果提取渣为原料，通过籽壳液分离、低温干燥、粉碎、湿法膨化、冷榨、离心过滤、逆流萃取脱胶除酸、真空脱水、复合脱色、板框过滤、陶瓷膜澄清等步骤，得到罗汉果籽油。但是，该方法同样需要将罗汉果籽干燥，且步骤冗繁复杂，设备投入大，收率偏低，不适合工业化生产。
目前，尚无从罗汉果中提取β-谷甾醇的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种所得罗汉果籽油、β-谷甾醇含量及收率高，工艺过程可操作性强，成本低，罗汉果资源高效综合利用，适宜于工业化生产的从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油及β-谷甾醇的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油的方法，包括以下步骤：
（1）回流提取：向罗汉果提取渣中加入水和脂溶性有机溶剂，搅拌回流提取，将提取液静置分层，除去下层的水层，得有机提取液；
（2）填充柱吸附：将步骤（1）所得有机提取液上填充柱吸附，收集流出液，得罗汉果籽粗油溶液；
（3）精制：向步骤（2）所得罗汉果籽粗油溶液中加入脱色剂，加热搅拌，冷却至室温后，再用超滤膜过滤，超滤液浓缩至无溶剂，得罗汉果籽油精品。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果提取渣的水含量为50～60%。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果提取渣为罗汉果鲜果用水提取甜苷之后的废渣，主要包含罗汉果籽渣和罗汉果果壳渣，其中，所含有的罗汉果籽油在湿基中的质量含量为5～8%，β-谷甾醇在湿基中的质量含量为1～4%。
优选地，步骤（1）中，水以及脂溶性有机溶剂的体积与罗汉果提取渣湿基质量的体积质量比（l/l/kg）为0.5～1.0:15～20:1。加水的目的是溶解和分离罗汉果提取渣中的黄酮类、蛋白质、多糖等水溶性的杂质。若水的用量过多，将影响罗汉果籽油和β-谷甾醇的浸出，且将增大废水的排放量；若水的用量过少，则水溶性杂质浸出不彻底，将降低罗汉果籽油和β-谷甾醇的外观颜色和含量。若脂溶性有机溶剂用量过多，则会增加后续步骤的处理量以及溶剂的消耗，造成浪费；若脂溶性有机溶剂用量过少，则罗汉果籽油和β-谷甾醇将难以充分浸出。
优选地，步骤（1）中，所述脂溶性有机溶剂为石油醚、6#抽提溶剂油、120#抽提溶剂油或乙酸乙酯等中的一种或几种。
优选地，步骤（1）中，所述搅拌回流提取的转速为20～60r/min，温度为75～85℃，时间为2～4h。搅拌的目的是将有机溶剂、水和提取渣充分接触，提高提取的效率。若搅拌的转速过快，则易导致有机溶剂和水乳化，使得后续步骤难以分层；若搅拌的转速过慢，则有机溶剂、水和提取渣难以充分接触，导致提取不完全。
优选地，步骤（1）中，所述静置分层的时间为1～2h。静置分层是利用密度的差异，将含有罗汉果籽油和β-谷甾醇的脂溶性有机溶剂层与含有水溶性杂质的水层分层，将水层排出后，水溶性杂质遂得以去除。
优选地，步骤（2）中，上柱的流速为0.1～1.0bv/h。
优选地，步骤（2）中，所述填充柱的高径比为2～10:1（更优选4～8:1）。
优选地，步骤（2）中，所述填充柱中的填充剂与罗汉果提取渣湿基的体积质量比（l/kg）为0.1～0.5:1。
上柱吸附的目的：一是，将β-谷甾醇吸附于填充剂上，使其与有机溶剂提取液中的罗汉果籽油分离；二是，除去有机溶剂提取液中的脂溶性色素；三是，除去有机溶剂提取液中少量的水。若上柱流速过快，填充柱的高径比过小，或填充剂的用量过少，都将难以充分的达到上述目的；若上柱流速过慢，填充柱的高径比过大，或填充剂的用量过多，都将造成能源和物料的浪费。
优选地，步骤（2）中，所述填充柱中的填充剂为硅胶、反相硅胶或氧化铝等中的一种或几种。所述填充剂中的“硅胶”即有别于“反相硅胶”的“正相硅胶”，“硅胶”为本领域对“正相硅胶”的惯常称呼，“硅胶”与“反相硅胶”并不存在上下位关系。
优选地，步骤（3）中，所述脱色剂的用量相当于罗汉果提取渣湿基质量的1～5%（更优选2～4%）。若脱色剂的用量过多，则将造成物料的浪费，并加大超滤膜过滤的负担；若脱色剂的用量过少，则脱色的效果不彻底，直接影响罗汉果籽油的外观。
优选地，步骤（3）中，所述脱色剂为硅藻土、活性炭、膨润土、活性氧化铝或凹凸棒等中的一种或几种。
优选地，步骤（3）中，所述加热搅拌的温度为40～60℃，时间为1～2h。加热、搅拌的目的是使脱色剂与罗汉果籽粗油溶液充分接触，发挥脱色剂对色素的吸附效果。若加热的温度过高或搅拌的时间过长，则将造成溶剂和能源的损耗；若加热的温度过低或搅拌的时间过短，则脱色剂对色素的吸附将不彻底。
优选地，步骤（3）中，所述超滤膜的截留分子量为500～3000da（更优选800～2000da）。
优选地，步骤（3）中，所述过滤的压力为0.5～2.0mpa。
超滤的目的是除去脱色剂、悬浮物以及罗汉果籽粗油溶液中微量的蛋白质、糖类等大分子杂质，并降低罗汉果籽粗油溶液的浊度。若超滤膜截留分子量过大或过滤压力过大，则大分子杂质有可能透过超滤膜进入透过液，导致罗汉果籽粗油溶液的浊度偏高；若超滤膜截留分子量过小或过滤压力过小，则将造成罗汉果籽油的损失，且将减慢过滤的速度。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：在所述从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油的同时提取β-谷甾醇的方法，将步骤（2）中上柱吸附后的填充柱用碱液洗脱，洗脱液用脂溶性有机溶剂萃取，静置分层，除去下层的水层，有机层用水洗涤至中性，浓缩，干燥，得β-谷甾醇粗品；再将β-谷甾醇粗品用低碳醇加热溶解，加入水，降温，搅拌析晶，过滤，洗涤晶体，干燥，得β-谷甾醇精品。
优选地，所述碱液的用量为2～5bv。
优选地，所述碱液为氢氧化钠和/或氢氧化钾的水溶液，质量浓度为1～5%。
优选地，所述洗脱的流速为0.1～1.0bv/h。
用碱液洗脱的目的：一是，将吸附于树脂柱上的β-谷甾醇解吸；二是，将同时解吸出的酯类杂质皂化成盐，使其溶解于碱液，而无法被有机溶剂萃取出，从而提高萃取液中β-谷甾醇的纯度。若碱液的用量过少、浓度过低或洗脱流速过快，都将难以充分达到上述目的；若碱液的用量过多、浓度过高或洗脱流速过慢，都将造成能源和物料的浪费。
优选地，所述脂溶性有机溶剂与罗汉果提取渣湿基的体积质量比（l/kg）为0.5～1.0:1。用脂溶性有机溶剂萃取的目的是将碱液洗脱液中的β-谷甾醇提取出来。若脂溶性有机溶剂的用量过少，则β-谷甾醇将难以充分提取，收率将降低；若脂溶性有机溶剂的用量过多，则将造成能源和物料的浪费。
优选地，所述脂溶性有机溶剂为石油醚、6#抽提溶剂油、120#抽提溶剂油或乙酸乙酯等中的一种或几种。
优选地，所述静置分层的时间为1～3h。静置分层是利用密度的差异，将含有β-谷甾醇的脂溶性有机溶剂层与含有水溶性杂质的水层分层，将水层排出后，水溶性杂质遂得以去除。
优选地，所述低碳醇与β-谷甾醇粗品的体积质量比（l/kg）为2～5:1。若低碳醇的用量过少，则β-谷甾醇粗品将难以完全溶解；若低碳醇的用量过多，则溶液的浓度过低，将造成结晶的收率偏低。
优选地，所述加热的温度为40～70℃。
优选地，所述水与低碳醇的体积比为0.5～3.0:1。加水的目的是增大低碳醇溶液的极性，使β-谷甾醇的溶解度降低而析出。若水的加入量过多，则低碳醇溶液的极性过大，其它的杂质也将析出，从而影响β-谷甾醇结晶的纯度；若水的加入量过少，则β-谷甾醇的析出将不彻底，从而影响β-谷甾醇结晶的收率。
优选地，所述搅拌析晶的温度为5～10℃，搅拌的速度为20～60r/min，搅拌析晶的时间为12～24h。
优选地，所述低碳醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等中的一种或几种。
优选地，所述过滤为离心过滤。
优选地，用冷冻的低碳醇洗涤晶体。用冷冻的低碳醇洗涤晶体的目的是：除去晶体表面无法彻底过滤干净的结晶母液，以提高晶体的纯度与含量。
优选地，所述冷冻的低碳醇与β-谷甾醇粗品的体积质量比（l/kg）为0.5～1.0:1。
优选地，所述冷冻的低碳醇的温度为-5～5℃。
若冷冻低碳醇的用量过少或温度过低，都将难以彻底洗去晶体表面残留的结晶母液；若冷冻低碳醇的用量过多或温度过高，都将导致β-谷甾醇的损失。
优选地，所述低碳醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等中的一种或几种。
本发明方法中，1bv=1个柱体积。
本发明方法的原理是：用水和脂溶性有机溶剂将罗汉果提取渣搅拌回流提取，罗汉果籽油和β-谷甾醇容易被脂溶性有机溶剂提取出，而大量的水溶性杂质则溶解于水中，通过静置分层可将水和溶解其中的水溶性杂质除去；再利用填充剂只吸附β-谷甾醇而不吸附罗汉果籽油的特性，可将两者分离。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法所得罗汉果籽油精品为淡黄色，感官要求和理化指标均达到了gb2716-2005《食用植物油卫生标准》，其中，油酸、亚油酸和棕榈酸的含量分别高达26.5%，36.6%和23.4%，罗汉果籽油的收率高达97.3%；所得β-谷甾醇精品中，β-谷甾醇的含量高达99.9%，收率高达94.1%；
（2）本发明方法是一种全新的从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油及同时提取β-谷甾醇的方法，工艺过程可操作性强，成本低，罗汉果资源高效综合利用，不但解决了罗汉果生产中固废的处理问题，还能创造可观的经济效益，适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的罗汉果提取渣为罗汉果鲜果用水提取甜苷之后的废渣，水含量为52%，主要包含罗汉果籽渣和罗汉果果壳渣，其中，所含有的罗汉果籽油在湿基中的质量含量为6.28%，β-谷甾醇在湿基中的质量含量为2.3%；本发明实施例所使用的硅胶、反相硅胶和氧化铝均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的超滤膜均购于济南海德水处理设备有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用气相色谱-质谱联用仪检测罗汉果籽油的含量，采用高效液相色谱检测β-谷甾醇的含量。
实施例1
从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油的方法：
（1）回流提取：向100kg罗汉果提取渣中加入50l水和1500l6#抽提溶剂油，在转速30r/min，80℃下，搅拌回流提取3h，将提取液静置分层2h，除去下层的水层，得有机提取液；
（2）硅胶柱吸附：将步骤（1）所得有机提取液以流速0.5bv/h，上硅胶柱（硅胶柱的高径比为4:1，硅胶的体积为50l）吸附，收集流出液，得罗汉果籽粗油溶液；
（3）精制：向步骤（2）所得罗汉果籽粗油溶液中加入2kg硅藻土，在50℃下，加热搅拌1h，冷却至室温后，再用截留分子量为1000da的超滤膜，在2.0mpa下过滤，超滤液浓缩至无溶剂，得6.05kg罗汉果籽油精品。
同时提取β-谷甾醇的方法：
将步骤（2）中上柱吸附后的硅胶柱用100l、质量浓度为2%的氢氧化钠水溶液，以流速0.5bv/h洗脱，洗脱液用100l6#抽提溶剂油萃取，静置分层1.5h，除去下层的水层，有机层用水洗涤至中性，浓缩，干燥，得2.5kgβ-谷甾醇粗品；再将2.5kgβ-谷甾醇粗品用7.5l乙醇，在60℃下加热溶解，加入4.5l水，降温至5℃，在转速30r/min下，搅拌析晶12h，离心过滤，用1.8l、0℃冷冻的乙醇洗涤晶体，干燥，得2.16kgβ-谷甾醇精品。
本发明实施例所得罗汉果籽油精品为淡黄色，感官要求和理化指标均达到了gb2716-2005《食用植物油卫生标准》；经气相色谱-质谱联用仪检测，本实施例所得罗汉果籽油精品中，油酸、亚油酸和棕榈酸的含量分别为25.2%，36.6%和21.7%，罗汉果籽油的收率为97.3%；经高效液相色谱检测，本实施例所得β-谷甾醇精品中，β-谷甾醇的含量为99.8%，β-谷甾醇的收率为93.7%。
实施例2
从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油的方法：
（1）回流提取：向200kg罗汉果提取渣中加入150l水和4000l石油醚，在转速60r/min，85℃下，搅拌回流提取2h，将提取液静置分层2h，除去下层的水层，得有机提取液；
（2）反相硅胶柱吸附：将步骤（1）所得有机提取液以流速1.0bv/h，上反相硅胶柱（反相硅胶柱的高径比为8:1，反相硅胶的体积为40l）吸附，收集流出液，得罗汉果籽粗油溶液；
（3）精制：向步骤（2）所得罗汉果籽粗油溶液中加入5kg硅藻土，在40℃下，加热搅拌2h，冷却至室温后，再用截留分子量为2000da的超滤膜，在1.0mpa下过滤，超滤液浓缩至无溶剂，得11.8kg罗汉果籽油精品。
同时提取β-谷甾醇的方法：
将步骤（2）中上柱吸附后的反相硅胶柱用100l、质量浓度为3%的氢氧化钾水溶液，以流速1.0bv/h洗脱，洗脱液用150l石油醚萃取，静置分层2h，除去下层的水层，有机层用水洗涤至中性，浓缩，干燥，得5.1kgβ-谷甾醇粗品；再将5.1kgβ-谷甾醇粗品用20.4l甲醇，在50℃下加热溶解，加入40.8l水，降温至5℃，在转速40r/min下，搅拌析晶24h，离心过滤，用5.1l、-2℃冷冻的甲醇洗涤晶体，干燥，得4.33kgβ-谷甾醇精品。
本发明实施例所得罗汉果籽油精品为淡黄色，感官要求和理化指标均达到了gb2716-2005《食用植物油卫生标准》；经气相色谱-质谱联用仪检测，本实施例所得罗汉果籽油精品中，油酸、亚油酸和棕榈酸的含量分别为24.7%，34.9%和20.5%，罗汉果籽油的收率为95.2%；经高效液相色谱检测，本实施例所得β-谷甾醇精品中，β-谷甾醇的含量为99.9%，β-谷甾醇的收率为94.1%。
实施例3
从罗汉果提取渣中提取罗汉果籽油的方法：
（1）回流提取：向100kg罗汉果提取渣中加入80l水和2000l乙酸乙酯，在转速40r/min，78℃下，搅拌回流提取4h，将提取液静置分层1.5h，除去下层的水层，得有机提取液；
（2）氧化铝柱吸附：将步骤（1）所得有机提取液以流速0.5bv/h，上氧化铝柱（氧化铝柱的高径比为5:1，氧化铝的体积为40l）吸附，收集流出液，得罗汉果籽粗油溶液；
（3）精制：向步骤（2）所得罗汉果籽粗油溶液中加入3kg活性炭，在45℃下，加热搅拌2h，冷却至室温后，再用截留分子量为800da的超滤膜，在2.0mpa下过滤，超滤液浓缩至无溶剂，得5.72kg罗汉果籽油精品。
同时提取β-谷甾醇的方法：
将步骤（2）中上柱吸附后的氧化铝柱用160l、质量浓度为1.5%的氢氧化钠水溶液，以流速0.5bv/h洗脱，洗脱液用100l乙酸乙酯萃取，静置分层2.5h，除去下层的水层，有机层用水洗涤至中性，浓缩，干燥，得2.4kgβ-谷甾醇粗品；再将2.4kgβ-谷甾醇粗品用12l异丙醇，在65℃下加热溶解，加入36l水，降温至10℃，在转速20r/min下，搅拌析晶16h，离心过滤，用1.2l、5℃冷冻的异丙醇洗涤晶体，干燥，得2.13kgβ-谷甾醇精品。
本发明实施例所得罗汉果籽油精品为淡黄色，感官要求和理化指标均达到了gb2716-2005《食用植物油卫生标准》；经气相色谱-质谱联用仪检测，本实施例所得罗汉果籽油精品中，油酸、亚油酸和棕榈酸的含量分别为26.5%，34.1%和23.4%，罗汉果籽油的收率为92.3%；经高效液相色谱检测，本实施例所得β-谷甾醇精品中，β-谷甾醇的含量为99.8%，β-谷甾醇的收率为92.6%。