一株产几丁质酶的链霉菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株产几丁质酶的链霉菌及其应用。

背景技术

大豆是我国主要粮食作物，也是主要的经济作物和饲料作物。伴随着人口的不断增长，生活水平的改善和提升，大豆的产量和质量是人们关注的焦点。大豆的灰霉病、黑斑病会侵染大豆整个生长时期，从而引发大豆病害，在吉林、辽宁、黑龙江、江苏、四川等省份均有分布。从已有的报道得知，大豆灰霉病、黑斑病不仅侵染大豆，在人参、柑橘、甘薯、甘蓝、枣果、月季等植物上均具有致病性。

目前控制大豆灰霉病、黑斑病的主要方法仍是以化学农药为主，但是鉴于化学农药存在着农残隐患。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决现有控制大豆灰霉病、黑斑病的方法存在着农残隐患的问题，提供了一株产几丁质酶的链霉菌及其应用。

本发明的一株产几丁质酶的链霉菌为链霉菌(streptomycessp.)g6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年02月02日，保藏编号为cgmccno.15334。

本发明的一株产几丁质酶的链霉菌的应用是指在大豆病害防治上的应用。

本发明采用野生稻根际土壤中进行产几丁质酶菌株的分离纯化：

初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出产几丁质酶的链霉菌streptomycessp.g6，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定g6菌株的生理生化特征发现，g6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树(图2)。g6菌株与链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为链霉菌(streptomycessp.)g6。

本发明提供了在野生稻根际土壤中筛选得到具有几丁质酶活且对大豆灰霉病、黑斑病有抑制作用的链霉菌g6菌株，保藏编号为cgmccno.15334，它是在江西东乡不同地点的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与大豆灰霉病、黑斑病拮抗效果好的菌株，经大量的实验证明，菌株g6不仅具有几丁质酶活，且对大豆灰霉病、黑斑病有很好的拮抗作用，g6发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.7％，对黑斑病的抑制效果达到85.5％。

本发明利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

附图说明

图1为g6菌株在pda平板上的形态图；

图2为g6菌株分子鉴定聚类图谱；

图3为g6菌株与灰霉病的拮抗效果图；

图4为g6菌株与黑斑病的拮抗效果图；

图5为g6发酵液和灰霉病特效素对灰霉病抑制效果图；

图6为g6发酵液和苯醚甲环唑对黑斑病抑制效果图；

图7为g6发酵液和灰霉病特效素对灰霉病抑制效果的对比图；其中a为g6发酵液，b为灰霉病特效素；

图8为g6发酵液和苯醚甲环唑对黑斑病抑制效果的对比图；其中a为g6发酵液，c为苯醚甲环唑。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株产几丁质酶的链霉菌为链霉菌(streptomycessp.)g6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年02月02日，保藏编号为cgmccno.15334。

本实施方式采用野生稻根际土壤中进行产几丁质酶菌株的分离纯化：

初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出产几丁质酶的链霉菌streptomycessp.g6，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定g6菌株的生理生化特征发现，g6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树(图2)。g6菌株与链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为链霉菌(streptomycessp.)g6。

本实施方式利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

具体实施方式二：本实施方式一株产几丁质酶的链霉菌的应用是指在大豆病害防治上的应用。

本实施方式提供了在野生稻根际土壤中筛选得到具有几丁质酶活且对大豆灰霉病、黑斑病有抑制作用的链霉菌g6菌株，保藏编号为cgmccno.15334，它是在江西东乡不同地点的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与大豆灰霉病、黑斑病拮抗效果好的菌株，经大量的实验证明，菌株g6不仅具有几丁质酶活，且对大豆灰霉病、黑斑病有很好的拮抗作用，g6发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.7％，对黑斑病的抑制效果达到85.5％。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：产几丁质酶的链霉菌应用在对黑斑病的抑制上。其他与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：产几丁质酶的链霉菌应用在对灰霉病的抑制上。其他与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式四：本实施方式产几丁质酶的链霉菌streptomycessp.g6的筛选方法为：初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出产几丁质酶的链霉菌streptomycessp.g6，g6菌株在pda平板上的形态图如图1所示。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定g6菌株的生理生化特征发现，g6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

具体实施方式五：本实施方式产几丁质酶的链霉菌streptomycessp.g6的鉴定：

1.生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定g6菌株的生理生化特征发现，g6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

表1菌株g6的生理生化特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.分子鉴定

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr通用引物为：27f(5ˊ-agagtttgatcctggctcag-3ˊ)，1492r(5ˊ-ggttaccttgttacgactt-3ˊ)，反应体系25μl，premixversion2.012.5μl，27f(10nm)1μl，1492r(10nm)1μl，dna模板1μl，无菌水不足至25μl。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min。

pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树(图2)。g6菌株与链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为链霉菌(streptomycessp.)g6。

对本实施方式的产几丁质酶的链霉菌streptomycessp.g6在对大豆灰霉病、黑斑病拮抗上的功能性验证：

试验1、平板对峙法对大豆灰霉病、黑斑病拮抗作用

采用平板对峙法，测定拮抗菌株对灰霉病、黑斑病的抑菌活性。先将大豆灰霉病、黑斑病分别在pda平板上进行活化，挑选长势旺盛的病原菌平板。用打孔器制成直径为7mm的菌饼，倒置于pda平板，将拮抗菌菌株的菌饼接种在距病原菌约2cm处，其中以不接拮抗菌的平板为对照，每组3个重复，置于26℃下恒温培养箱中培养2-6天，观察抑菌圈的大小(图3，图4)。并在第2,4,6天的时候记录病原菌的菌落最小半径以及对照菌落的半径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照菌落半径×100

从不同天数的抑菌率数据来看，g6菌株在第6天时对灰霉病的抑制效果仍能达到82.3％，对黑斑病的抑制效果达79.9％。

试验2：g6发酵液分别和灰霉病特效素、苯醚甲环唑对灰霉病、黑斑病的抑制效果

g6发酵液的制备：250ml三角瓶中装入100ml发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖10.0g，酵母浸膏7.5g加蒸馏水定容至1000ml)，121℃下高压灭菌。在超净工作台中将g6菌饼接入到冷却的液体培养基中，于160rpm恒温震荡摇床中发酵培养3天后，得到发酵液，将发酵液3500rpm离心5分钟收集菌体，无菌水洗涤2次后重悬浮无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释浓度为10⁷cfu/ml，备用。

农药稀释液制备：将市售灰霉病特效素(北美农大)和苯醚甲环唑(50％)(北美农大)按照使用说明稀释500-1000倍，为了验证g6对病原菌的抑制效果，我们对灰霉病特效素和苯醚甲环唑分别进行了250倍稀释和500倍稀释。

拮抗试验：分别取100μlg6的发酵滤、250倍灰霉病特效素稀释液、500倍灰霉稀释液、250倍50％苯醚甲环唑稀释液、500倍苯醚甲环唑稀释液涂布于pda平板，平皿中央分别接种7mm灰霉病、黑斑病病原菌菌饼，以无菌水为对照(图5，图6)，每组3个重复，26℃下恒温培养，在第2，3，4，5天测量病原菌的直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-病原菌菌落直径)/对照菌落直径×100％

结果显示：由于500倍稀释的灰霉病特效素和苯醚甲环唑几乎对灰霉病和黑斑病无抑制效果，因此仅在图中比较了g6发酵液和250倍灰霉病特效素和苯醚甲环唑的抑制作用(图7，图8)，其中随着天数的增加g6发酵液对灰霉病和黑斑病的抑制效果逐渐增强，在第5天时，g6发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.7％，对黑斑病的抑制效果达到85.5％，而灰霉病特效素和苯醚甲环唑的效果在逐渐降低，灰霉病特效素和苯醚甲环唑均在第2天的抑制效果最好，分别为95.9％和47.3％。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一株产几丁质酶的链霉菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1428

<212>dna

<213>链霉菌（streptomycessp.）

<400>1

cgccggcgggcgtgctacacatgcagtcgacgatgaagcccttcggggtggattagtggc60

gaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacgg120

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物27f的核苷酸序列。

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物1492r核苷酸序列。

<400>3

ggttaccttgttacgactt19