用于分离和培养猪肺炎支原体的固体培养基及其制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及用于分离和培养猪肺炎支原体的固体培养基及其制备方法。
背景技术：
:近年来，随着经济的不断发展，养殖业的发展也不断随之进步。对于生猪的养殖业不断产业化、规模化、科学化。生猪的饲养条件有了明显的、大幅度的改善。对于一些烈性传染病的防控已得到人们充分的认识，但对猪支原体病的认识及防控还未能引起广泛的关注。猪支原体病（mycoplasmaldiseases）是兽医学临床上一种常见的、危害极大的疾病。猪支原体病主要为由猪肺炎支原体等引发的，以呼吸系统疾病为主的猪支原体肺炎；以及以猪滑液支原体等引发的以关节病为主的猪滑液囊支原体病。早在20世纪60年代美国科学家mare和switzer就从患猪支原体肺炎的病猪中提取分离出了猪肺炎支原体。2001年美国国家动物健康检测部门对全国养殖猪群做了调查，在万头猪场，52.7％架子猪和68％育肥猪感染过支原体相关疾病，超过其中50％的疾病被诊断为猪支原体肺炎。猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎，我国俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，可造成带菌病猪生长发育缓慢、生长率降低、饲料转化率降低以及饲料和人力的浪费。此外，猪肺炎支原体能够引起机体免疫抑制，致使其他疫苗免疫失败。根据初步统计，该病阳性感染率大概为70％-90％，发病率至少40％以上。患猪生长不良，饲料转化率降低13.8％，生产率下降15.9％，极大增加养猪成本，使经济收入下降，估计我国每年由此病损失可达100亿元以上。此外，mps的病死率虽不高，但其引发的继发性感染可出现严重死亡，造成的经济损失巨大。规模化猪场中mps常和数种细菌、病毒等病原协同作用，而引起猪呼吸道疾病综合征(prdc)严重制约着养猪业的发展。长期以来，该病被认为是威胁全球养猪业的主要传染病之一。然而，我国猪肺炎支原体的分离培养难度很大，传统的培养方式耗时长，并且滴度不高，是目前支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。现有的培养猪肺炎支原体的培养基主要有1975年报道的friis培养基、1975年江苏农科院发明的km2培养基、《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二000年版)中提出的猪肺炎支原体培养基和2006年农业行业标准中提到的a26培养基。随着技术的发展，专利文献中也报道了多种猪肺炎支原体培养基，例如发明专利申请cn201210318816.x公开了一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基，包括(1)基础培养基（2）辅助培养基，主要有mem、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，无机盐等组成，该培养基能够既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液效价高达109ccu/ml;同时该培养基采用降低猪血清培养猪肺炎支原体，减轻了猪血清对猪体的过敏应激反应，既考虑到动物的生物安全，又提高了抗原效价，而且降低了生产成本。发明专利申请cn201510042434.2公开了一种培养猪肺炎支原体培养基，是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混合，调整ph，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。所述的猪肺炎支原体培养基培养猪肺炎支原体cj株的生长时间为2-3日，含菌量为1.0×109-10ccu/ml，达到最终含菌量的测定时间为9-10日。发明专利申请cn201710123741.2公开了一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有hank’s液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心提取物，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌，大大地减少了过滤除菌带来的污染风险；辅助培养基由猪血清、精氨酸、半胱氨酸、酚红溶液、青霉素等组成，猪血清通过钴照射除菌，其余成分过滤除菌后与灭活的猪血清混合。所述培养基培养猪肺炎支原体兔化弱毒株的滴度达到109-1010ccu，培养时间最低可至40h，大大减少了陈旧菌、老龄菌的产生，并且猪血清用量可以低至8％，减少了猪血清带来的过敏应激反应，降低了企业生产成本。然而，尽管专利报道资料很多，但市场上仍未出现相关的培养基产品。基于以上技术问题的存在，本发明人开展了猪肺炎支原体培养基的优化研究。技术实现要素：为解决现有技术中缺乏高效分离和培养猪肺炎支原体的培养基，相关支原体分离困难等技术问题，本发明旨在提供一种猪肺炎支原体的固体培养基及其制备方法，以及探究了其在分离猪肺炎支原体中的应用。本发明的猪肺炎支原体的固体培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，准确性高，能够用于猪肺炎支原体感染的相关检测。为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：一种猪肺炎支原体的固体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体固体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×hank’s25-35ml、pplo肉汤粉2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1ml、琼脂粉18-22g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水850-900ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3-4ml、5％半胱氨酸溶液2-3ml、1%牛磺酸溶液1-2ml，5％辅酶ι1-5ml、10万u/ml青霉素5-10ml和灭活的健康猪血清70-90ml组成。优选的，所述基础培养基由20×hank’s30ml、pplo肉汤粉2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75ml、琼脂粉20g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5ml、5％半胱氨酸溶液2.5ml、1%牛磺酸溶液1ml，5％辅酶ι3ml、10万u/ml青霉素8ml和灭活的健康猪血清75ml组成。优选的，所述基础培养基由20×hank’s35ml、pplo肉汤粉3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1ml、琼脂粉18g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水850ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4ml、5％半胱氨酸溶液3ml、1%牛磺酸溶液1ml，5％辅酶ι5ml、10万u/ml青霉素7ml和灭活的健康猪血清70ml组成。优选的，所述基础培养基由20×hank’s25ml、pplo肉汤粉2g、酵母提取物5g、乳清蛋白水解物0.5g、脑心浸液粉5g、1%氯化锌溶液0.5ml、琼脂粉22g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水880ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3ml、5％半胱氨酸溶液2ml、1%牛磺酸溶液1ml，5％辅酶ι2ml、10万u/ml青霉素5ml和灭活的健康猪血清90ml组成。本发明还请求保护所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×hank’s25-35ml、pplo肉汤粉2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1ml、0.25%酚红溶液10ml、琼脂粉18-22g和去离子水850-900ml，搅拌均匀，10mnaoh调ph至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液3-4ml、5％半胱氨酸溶液2-3ml、1%牛磺酸溶液1-2ml，5％辅酶ι1-5ml、10万u/ml青霉素5-10ml和56℃co60辐照灭活的健康猪血清70-90ml；第三，待基础培养基冷却至50-55℃时，向其中加入称取的辅助培养基，搅拌均匀，趁热倒入90mm平皿中，每个平皿10-15ml，冷却，即得到所述的猪肺炎支原体固体培养基。本发明还请求保护所述猪肺炎支原体固体培养基在分离猪肺炎支原中的应用，所述分离的猪肺炎支原体可以用于疫苗的制备。一种猪肺炎支原体的分离方法，其特征在于，采用本发明所述的猪肺炎支原体固体培养基进行分离培养，具体是将猪肺组织灌洗液或者猪肺组织匀浆采用0.22μm的滤器进行过滤后，将滤液均匀涂布在本发明的猪肺炎支原体固体培养基上，放置于37℃，co2浓度为5%的细胞培养箱培养2-4天，用电子显微镜观察其形态，支原体在接种2-4天后会在固体培养基上呈现出“油煎蛋”形态。基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：首先，本发明基于现有猪肺炎支原体培养基研究的基础上，对现有的培养基进行了改进，特别是成分组成的调整，从而优化猪肺炎支原体的分离和培养的效率。在本发明中，发明人经研究发现在猪肺炎支原体固体培养基中添加微量的氯化锌溶液以及少量牛磺酸溶液，能够显著改善猪肺炎支原体的培养状况，其能极大地促进猪肺炎支原体的增殖和生长，可以更好的运用于支原体的分离和培养。其次，本发明中采用少量的猪血清，相比现有技术的血清含量，本发明的培养基中血清含量更低，达到8%左右，这一方面降低了企业的生产成本，另一方面也能减少血清的添加所带来的致敏性问题等。第三，本发明的猪肺炎支原体培养基能够有效地从猪肺灌洗液中分离和鉴定猪肺炎支原体，其相比传统的猪肺炎支原体的分离和鉴定方法具有更高的准确性。表明本发明的固体培养基能够有效地用于猪肺炎支原体的分离和鉴定。综上所述，本发明的猪肺炎支原体固体培养基能够用于猪肺炎支原体的分离和培养，且相比现有技术的血清含量，本发明的培养基中血清含量更低，达到8%左右，降低了企业的生产成本，且相比传统的分离方法，本发明的分离时间更短，效率更高。说明书附图说明：图1：猪肺炎支原体固体培养情况：1-a是接种后1天，1-b是接种后2天，1-c是接种后4天的形态，呈现典型的“油煎蛋”形态。图2：猪肺炎支原体pcr鉴定结果，其中通道1为dl2000marker，通道2为实施例5样品1，通道3为水作为阴性对照。具体实施方式：实施例1：一种猪肺炎支原体的固体培养基，所述猪肺炎支原体固体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×hank’s30ml、pplo肉汤粉2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75ml、琼脂粉20g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5ml、5％半胱氨酸溶液2.5ml、1%牛磺酸溶液1ml，5％辅酶ι3ml、10万u/ml青霉素8ml和灭活的健康猪血清75ml组成。所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×hank’s、pplo肉汤粉、酵母提取物、乳清蛋白水解物、脑心浸液粉、1%氯化锌溶液、0.25%酚红溶液、琼脂粉和去离子水，搅拌均匀，10mnaoh调ph至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液、5％半胱氨酸溶液、1%牛磺酸溶液、5％辅酶ι、10万u/ml青霉素和56℃co60辐照灭活的健康猪血清；第三，待基础培养基冷却至55℃时，向其中加入称取的辅助培养基，搅拌均匀，趁热倒入90mm平皿中，每个平皿15ml，冷却，即得到所述的猪肺炎支原体固体培养基。实施例2：一种猪肺炎支原体的固体培养基，所述猪肺炎支原体固体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×hank’s35ml、pplo肉汤粉3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1ml、琼脂粉18g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水850ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4ml、5％半胱氨酸溶液3ml、1%牛磺酸溶液1ml，5％辅酶ι5ml、10万u/ml青霉素7ml和灭活的健康猪血清70ml组成。所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×hank’s、pplo肉汤粉、酵母提取物、乳清蛋白水解物、脑心浸液粉、1%氯化锌溶液、0.25%酚红溶液、琼脂粉和去离子水，搅拌均匀，10mnaoh调ph至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液、5％半胱氨酸溶液、1%牛磺酸溶液、5％辅酶ι、10万u/ml青霉素和56℃co60辐照灭活的健康猪血清；第三，待基础培养基冷却至50℃时，向其中加入称取的辅助培养基，搅拌均匀，趁热倒入90mm平皿中，每个平皿15ml，冷却，即得到所述的猪肺炎支原体固体培养基。实施例3：一种猪肺炎支原体的固体培养基，所述猪肺炎支原体固体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×hank’s25ml、pplo肉汤粉2g、酵母提取物5g、乳清蛋白水解物0.5g、脑心浸液粉5g、1%氯化锌溶液0.5ml、琼脂粉22g、0.25%酚红溶液10ml和去离子水880ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3ml、5％半胱氨酸溶液2ml、1%牛磺酸溶液1ml，5％辅酶ι2ml、10万u/ml青霉素5ml和灭活的健康猪血清90ml组成。所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×hank’s、pplo肉汤粉、酵母提取物、乳清蛋白水解物、脑心浸液粉、1%氯化锌溶液、0.25%酚红溶液、琼脂粉和去离子水，搅拌均匀，10mnaoh调ph至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液、5％半胱氨酸溶液、1%牛磺酸溶液、5％辅酶ι、10万u/ml青霉素和56℃co60辐照灭活的健康猪血清；第三，待基础培养基冷却至55℃时，向其中加入称取的辅助培养基，搅拌均匀，趁热倒入90mm平皿中，每个平皿15ml，冷却，即得到所述的猪肺炎支原体固体培养基。实施例4：猪肺炎支原体培养采用猪肺炎支原体atcc25934(j株)，用103ccu/ml的猪肺炎支原体atcc25934(j株)涂布到本发明实施例1的猪肺炎支原体的固体培养基，放置于37℃，co2浓度为5%的细胞培养箱培养2-4天，用电子显微镜观察其形态，支原体在接种2-4天后会在固体培养基上呈现出“油煎蛋”形态，具体参见附图1。实施例5：猪肺炎支原体的分离选取江西省九江某屠宰场进行试验，共选取20头新宰杀猪，宰杀后及时取肺和气管等组织，采用生理盐水进行灌肺，获得肺部灌洗液，灌洗液采用0.22μm滤器进行过滤，收集滤液，将滤液分别进行pcr检测、本发明实施例1的平板涂布培养（放置于37℃，co2浓度为5%的细胞培养箱培养4天，用电子显微镜观察其形态，支原体在固体培养基上呈现出“油煎蛋”形态）和km2培养基培养（接种后培养20天，观察颜色变化，变黄则为阳性），验证猪肺炎支原体的感染情况。其中猪肺炎支原体的pcr检测选取p46基因作为检测基因，其上游引物为:5’-cgggatccacttcagattctaaaccacaa-3’，下游引物为：5’-ccaagcttttaggcatcaggattatcaac-3’，目标片段大小为1105bp。km2培养基为市售的支原体分离用培养基。具体分离检测结果如下表1：表1猪肺炎支原体的分离结果样品pcr实施例1km2结果样品pcr实施例1km2结果1++-+11+--+2++-+12++++3++++13++++4----14----5++++15----6++++16----7++-+17----8----18++-+9----19----10----20++++以上结果的确定是将三种检测方法中，当pcr检测结果与其他方法检测结果不一致时，选取pcr凝胶片段进行测序。对于样品10，经多次鉴定均为阴性。由以上结果可知，本次试验选取的20头猪中，阳性率为55%，而本发明实施例1的固体培养基分离鉴定的阳性率为50%，其与pcr检出的一致性高达90.9%；km2培养基的阳性检出率为30%，其与pcr检出的一致性高达54.5%。可见，本发明的猪肺炎支原体培养基能够有效地从猪肺灌洗液中分离和鉴定猪肺炎支原体，其相比传统的猪肺炎支原体的分离和鉴定方法具有更高的准确性。表明本发明的固体培养基能够有效地用于猪肺炎支原体的分离和鉴定。当前第1页12