本发明涉及木质纤维素的微生物发酵领域，更特别地，涉及一种可降解木质纤维素的重组酿酒酵母菌株，其制备方法及其应用。
背景技术
木质纤维素是一种丰富有机资源，它有着获取容易和分布广泛等优点。其可以从杂草、木料、城市固体废料和农业残留物等获得。在自然界中，这些材料能够被微生物降解，生成水、二氧化碳和其它的物质。由于木质纤维素具有分布广泛和低成本的优点，它被视为一种很好的用来生产可再生能源如乙醇的资源。木质纤维素是植物生物质主要的组成成分，主要由三种聚合物组成，其中纤维素占到40％至50％、半纤维素有25至35％，木质素含量最少有15至20％，这三种聚合物根据木质纤维素来源的不同组分各异。
据统计，世界木质纤维素的生物量年产量约为1.4×1012至1.8×1012吨，但这些资源很多没有得到有效利用，大部分被焚烧或废弃。我国每年的农作物秸秆就有约80亿吨，三分之一以上都被燃烧或者废弃。理论上，木质纤维素中的纤维素和半纤维素通过生物催化的方法得到c5、c6糖，这些糖可以作为生产生物能源例如乙醇等的原料。纤维素和半纤维素分别占木质纤维素材料的40-50％和25-35％。这为木质纤维素用于能源、饲料、肥料、工业原料和基料等方面的应用提供了基础。然而，木质纤维素具有复杂的分子结构，纤维素、半纤维素和木质素纠缠联结，使其难以被微生物或者酶水解。因此，木质纤维素水解成为其规模化应用的最重要技术和经济限制因素，这也是利用木质纤维素制备生物能源或高营养饲料的原料的一大难题。
常常使用微生物发酵的方法来处理以木质纤维素为主体的秸秆来解决该问题。然而，目前尚没有合适的菌种进行单一发酵的时候能获得良好的效果，而混合菌发酵由于不同的菌种之间的比例不稳定，也影响发酵效率。
技术实现要素：
为解决以上问题，本发明提供了一种构建可降解木质纤维素的酿酒酵母菌株的方法，其包括向宿主酿酒酵母细胞中转入纤维素酶基因表达框和木聚糖酶基因表达框的步骤。
在一个优选实施方案中，所述纤维素酶基因表达框中的纤维素酶基因为genebank:kc751534.1。
在一个优选实施方案中，所述木聚糖酶基因表达框中的木聚糖酶基因为genebangk:ay156910.1和/或genebank:xx12596.1。
在一个优选实施方案中，所述宿主酿酒酵母菌为s.cerevisiaeinvsc。
本发明还提供了由上述方法构建的可降解木质纤维素的酿酒酵母菌株。
本发明还提供了上述降解木质纤维素的酿酒酵母菌株在降解木质纤维素或含有木质纤维素的物质中的应用。
本发明还提供了一种使用秸秆发酵制备乙醇的方法，包括使用上述可降解木质纤维素的酿酒酵母菌株发酵秸秆的步骤。
在一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：
s1：对所述秸秆进行预处理；
s2：将预处理过的秸秆配成发酵培养基；
s3：将所述可降解木质纤维素的酿酒酵母菌株接种于所述发酵培养基中发酵，即可得到乙醇。
在一个优选实施方案中，s1中，用浓度为30％的硝酸在70-75℃下处理所述秸秆2-3小时，用去离子水洗涤至滤液澄清，烘干得到预处理过的秸秆。
在一个优选实施方案中，s2中，所述发酵培养基包含1％酵母粉、2％蛋白胨、2％预处理后的秸秆。
在一个优选实施方案中，s3中，所述发酵在25-28℃的无氧条件下进行96-144h。
本发明的可降解木质纤维素的酿酒酵母菌株可有效降解木质纤维素或含有木质纤维素的物质，并且可在以木质纤维素为唯一碳源的培养环境中生长。本发明的可降解木质纤维素的酿酒酵母菌株还可以用于发酵秸秆得到乙醇。
附图说明
图1为phbm-368-pgk-cbh2-leu的质粒图；
图2为phbm-368-pgk-ts-leu的质粒图；
图3为phbm-368-pgk-ca-leu的质粒图；
图4为本发明的重组酵母菌株在以玉米秸秆作为唯一碳源的培养基中培养的生长曲线；
图5为本发明的重组酵母菌株在以玉米秸秆作为唯一碳源的无氧发酵产乙醇曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.质粒表达载体构建
根据在genebank找到的克隆载体pesc(genebank:af063849.1)其中所包含的亮氨酸序列设计并合成亮氨酸引物，在5’端加上一个sse8387i酶切位点，在3’端加上一个ncoi酶切位点。用载体pesc作为模板进行pcr扩增获得亮氨酸片段(leu)，片段大小为1124bp。
从目的基因组中克隆纤维素酶基因cbh2(genebank:kc751534.1)、木聚糖酶基因ts(genebangk:ay156910.1)和木聚糖酶基因ca(genebank:xx12596.1)。
将leu片段插入质粒表达载体phbm368的酶切位点ncoi与sse8387i之间。将上面克隆到的纤维素酶基因cbh2、木聚糖酶基因ts和木聚糖酶基因ca分别插至phbm368的pgk启动子下游，受该启动子调控转录，分别以下重组质粒：phbm-368-pgk-cbh2-leu(图1)、phbm-368-pgk-ts-leu(图2)和phbm-368-pgk-ca-leu(图3)。其中，phbm-368-pgk-cbh2-leu含有纤维素酶cbh2的表达框，phbm-368-pgk-ts-leu含有木聚糖酶ts的表达框，phbm-368-pgk-ca-leu含有木聚糖酶ca的表达框。经酶切验证，以上质粒表达载体均构建成功。
2.酿酒酵母细胞的电转化
将phbm-368-pgk-ts-leu和phbm-368-pgk-ca-leu分别与phbm-368-pgk-cbh2-leu等量混合，得到质粒混合物，将获得的两种混合质粒分别用于电转化酿酒酵母细胞。
将混合质粒用限制性内切酶hpai酶切，经过琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，乙醇沉淀法纯化线性dna，电转化法将线性dna转化到酿酒酵母s.cerevisiaeinvsc中，分别涂布于尿嘧啶营养缺陷型sc平板上、亮氨酸营养缺陷型sc平板上以及尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型sc-ura-lue平板上，28℃培养5-8天，在sc-ura-leu平板上生长出的酿酒酵母即为转化子。
3.重组酿酒酵母菌的筛选
3.1重组s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts的筛选
将使用phbm-368-pgk-cbh2-leu和phbm-368-pgk-ts-leu混合质粒转化酿酒酵母细胞得到的转化子挑到ypd固体培养基上生长48h后，将invsc-cbh2-ts转化子以及对照原始酿酒酵母invsc分别点菌至加有1％台酚蓝的以木聚糖为唯一碳源的ypd平板上，28℃培养数日。由于台酚蓝可结合大分子多糖物质，而无法结合小分子多糖，当转化子表达木聚糖酶分解木聚糖为小分子多糖时，转化子周围就会出现水解圈，因此可通过水解圈大小判断重组菌株中木聚糖酶的表达情况。
将使用phbm-368-pgk-cbh2-leu和phbm-368-pgk-ts-leu混合质粒转化酿酒酵母细胞得到的转化子挑到ypd固体培养基上生长48h后，将invsc-cbh2-ts转化子以及对照原始酿酒酵母invsc分别点菌至加有1％羧甲基纤维素(cmc)的ypd平板上，28℃培养数日。待菌落生长足够大时清洗菌落，喷洒刚果红染色液，静置15-20min后倒掉刚果红染色液，用nacl冲洗，菌落周围出现黄色水解圈，水解圈的大小可以反映纤维素酶在酿酒酵母重组菌中表达情况。
根据以上结果筛选到既表达纤维素酶cbh2又表达木聚糖酶ts的重组酿酒酵母菌株s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts。
3.2重组s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca的筛选
将使用phbm-368-pgk-cbh2-leu和phbm-368-pgk-ca-leu混合质粒转化酿酒酵母细胞得到的转化子挑到ypd固体培养基上生长48h后，将invsc-cbh2-ca转化子以及对照原始酿酒酵母invsc分别点菌至加有1％台酚蓝的以木聚糖为唯一碳源的ypd平板上，28℃培养数日。由于台酚蓝可结合大分子多糖物质，而无法结合小分子多糖，当转化子表达木聚糖酶分解木聚糖为小分子多糖时，转化子周围就会出现水解圈，因此可通过水解圈大小判断重组菌株中木聚糖酶的表达情况。
将使用phbm-368-pgk-cbh2-leu和phbm-368-pgk-ca-leu混合质粒转化酿酒酵母细胞得到的转化子挑到ypd固体培养基上生长48h后，将invsc-cbh2-ca转化子以及对照原始酿酒酵母invsc分别点菌至加有1％羧甲基纤维素(cmc)的ypd平板上，28℃培养数日。待菌落生长足够大时清洗菌落，喷洒刚果红染色液，静置15-20min后倒掉刚果红染色液，用nacl冲洗，菌落周围出现黄色水解圈，水解圈的大小可以反映纤维素酶在酿酒酵母重组菌中表达情况。
根据以上结果筛选到既表达纤维素酶cbh2又表达木聚糖酶ts的重组酿酒酵母菌株s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts。
4.重组酿酒酵母的纤维素酶与木聚糖酶酶活测定
将s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts、s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca和原始菌株s.cerevisiae接种至25mlypd培养基中，预培养24h后转接100mlypd液体培养基，培养至od600＝2.0左右，菌体进入生长稳定期，选择该时期的菌液测定酶活旨在消除培养基内葡萄糖对dns法测定酶活的影响。通过dns法分别测定两种酿酒酵母重组菌的表达的纤维素酶酶活和木聚糖酶活。测定结果如下：s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts与cmc-na反应后与对照的od540差值为0.294，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts与榉木木聚糖反应后与对照的od540差值为0.190，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca与cmc-na反应后与对照的od540差值为0.240，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca与榉木木聚糖反应后与对照的od540差值为0.132。根据dns法葡萄糖标准曲线推算得到相应葡萄糖浓度，再根据酶活定义进行推算得知，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts的纤维素酶活为931.27u/ml,木聚糖酶活为413.70u/ml。s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca的纤维素酶活为716.43u/ml,木聚糖酶活为205.13u/ml。
5.重组酿酒酵母菌利用玉米秸秆作为唯一碳源生长
将玉米秸秆用浓度为30％的硝酸(体积分数)在70-75℃下处理秸秆2-3小时，并去离子水洗涤至滤液澄清、备用烘干。用预处理后的玉米秸秆作为唯一碳源配制成液体培养基，培养基成分为：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％预处理后的秸秆(质量体积比：g/ml)。分别培养s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts和s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca，用平板计数法其生长情况，以原始菌株s.cerevisiaeinvsc和仅表达纤维素酶的菌株s.cerevisiaeinvsc-cbh2为对照。结果如图4所示，原始菌株在以玉米秸秆为唯一碳源的培养基中几乎不生长，s.cerevisiaeinvsc-cbh2能够在以玉米秸秆为唯一碳源的培养基中生长，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca的生长最快，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts次之，并且两者的生长速度都显著高于s.cerevisiaeinvsc-cbh2。
6.重组酿酒酵母菌利用玉米秸秆作为唯一碳源进行无氧发酵
将玉米秸秆进行预处理后，用玉米秸秆作为培养基(组分同上)的唯一碳源，在25-28℃无氧条件分别用s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts和s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca进行无氧发酵，测量其产乙醇的情况。以原始菌株s.cerevisiaeinvsc、仅表达纤维素酶的菌株s.cerevisiaeinvsc-cbh2、仅表达木聚糖酶的菌株s.cerevisiaeinvsc-ts、仅表达木聚糖酶的菌株s.cerevisiaeinvsc-ca为对照。
结果如图5所示，s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ts能够利用玉米秸秆作为唯一碳源生产乙醇，而其他菌株无法做到这一点，即便是同样表达了双酶的s.cerevisiaeinvsc-cbh2-ca效果亦不理想。由此可见，不同的纤维素酶和木聚糖酶组合可以产生意想不到的效果。在本实施例中，纤维素酶cbh2与木聚糖酶ts的组合可使酿酒酵母菌获得以玉米秸秆作为唯一碳源生产乙醇的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。