本发明涉及一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
多糖作为一种高分子碳水化合物，广泛存在于动植物和微生物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学活性。多糖主要有二糖单位组成，分为硫酸乙酰肝素、肝素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素。硫酸软骨素(cs)的相对分子质量大小对其发挥生物活性有着重要的影响。由于大分子的多糖体积较大，较难透过细胞膜从而不能很好的在机体内发挥其多种药理功能，而低分子量的cs具有溶解性好、粘度小、易吸收和生物利用度高等特点，因此，近年来低分子量cs的制备及其用途已逐步成为热点。
目前，降低多糖相对分子质量的方法主要有生物降解、化学降解、物理降解和氧化降解。生物降解主要是酶法降解，其特点是安全高效，但成本较高；化学降解可分为无机酸和有机酸，无机酸降解简便易行，成本较低，但污染严重，而有机酸降解相对较安全，但不同的有机酸对多糖的降解效率差异较大；酸法降解所得低分子硫酸基脱除率高达,并伴随有不饱和糖醛酸等不饱和结构产生，产物颜色为橘红色。物理降解主要是超声波降解和辐照降解，其特点是降解过程易控制，无污染；氧化降解以过氧化氢降解为主，其特点是副产物较少，相对分子质量分布较为集中。
酶法降解相对于其它的降解方法，具有反应条件温和、无污染、工艺简单，适合于cs低聚糖的工业化生产，具有较大的优势。但是不同来源的酶对硫酸软骨素降解的机理可能不同，导致最后产生的cs寡糖的结构和功能可能也会有所不同。硫酸软骨素裂解酶，裂解效果含不饱和双键，硫酸软骨素水解酶优势为无不饱和键。
目前还没有软骨素水解酶异源表达的报导：构建分泌酸软骨素水解酶重组菌株的基因来源牛，宿主毕赤酵母pichiapastorisgs115，质粒ppic9k，缺陷发酵周期长。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌，所述重组菌是以毕赤酵母pichiapastorisgs115为宿主，表达来源于牛的硫酸软骨素水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素水解酶的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素水解酶基因的氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法是：将核苷酸序列为seqidno.1的硫酸软骨素水解酶基因连接到表达载体ppic9k上，然后转化到毕赤酵母pichiapastorisgs115中，筛选正确的转化子，即得重组毕赤酵母pichiapastorisgs115/ppic9k-chase。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法在硫酸软骨素水解酶基因上添加组氨酸标签。
本发明的第三个目的是提供一种所述重组菌发酵生产硫酸软骨素水解酶的方法，所述方法在发酵罐中，采用甲醇诱导策略发酵生产硫酸软骨素水解酶。
在本发明的一种实施方式中，发酵方法具体步骤为：
将摇瓶培养的ypd种子液以10％的接种量接种于3l全自动发酵罐(liflusgmbiotron,korea)中，温度控制在25-30℃，使用25％氨水调节ph为5-6，初始搅拌转速为500-1000r·min-1，通气量为2-4l·min-1，溶氧维持在30％-35％以上。培养大约20-40h，od600约70-80待甘油耗尽，指数流加30-50％(w·v-1)甘油溶液(含12ml·l-1ptm1)，搅拌转速与溶氧相关联，控制转速在500-1000r·min-1补料12h，停止补料待甘油再次耗尽，od600约250(干重约60.0g·l-1)，转速在600-1000r·min-1并流加100％甲醇(含12ml·l-1ptm1)，甲醇浓度控制在18.0g·l-1，诱导温度分别采用30℃，25℃，22℃及阶段控制温度诱导策略。
本发明的第四个目的是提供一种所述硫酸软骨素水解酶分离纯化的方法，具体步骤如下：离心发酵液，收集上清液，上样；使用ni柱，用磷酸盐缓冲液平衡柱子10柱体积；采用咪唑梯度洗脱，咪唑用上述磷酸缓冲液配制，按照10mmol·l-1，30mmol·l-1，200mmol·l-1梯度洗脱。
本发明的有益效果：
(1)采用本发明的方法构建的基因工程菌在毕赤酵母中进行表达，是一种快速生产硫酸软骨素水解酶的方法。采用镍柱进行纯化，方法简便。
(2)毕赤酵母具有强有力的启动子aox，表达水平高，重组菌株稳定性较高，异源蛋白基因与表达质粒通过同源重组整合到p.pastoris基因组上，随染色体复制遗传且不容易丢失。具有糖基化、蛋白磷酸化、脂肪酞化等翻译后修饰加工功能。适应性强，营养要求低。分泌到胞外的蛋白种类比较少，且培养基中不含蛋白质，易于下游产物的分离与纯化。高密度发酵工艺较成熟，易进行放大培养。
(3)毕赤酵母分泌表达的硫酸软骨素水解酶表达量高、酶学性质稳定，耐ph、温度范围广。
附图说明
图1为毕赤酵母中构建chase的质粒图谱；
图2为毕赤酵母中检测chase具有水解肝素的活性：对照组a底物肝素加入失活的酶、实验组b底物加入chase；
图3为毕赤酵母中检测chase具有水解硫酸软骨素a(csa)的活性：对照组a底物csa加入失活的酶、实验组b底物加入chase；
图4为毕赤酵母中检测chase具有水解硫酸软骨素c(csc)的活性：对照组a底物csc加入失活的酶、实验组b底物加入chase；
图5为毕赤酵母中构建chase硫酸软骨素水解酶的sds-page电泳结果；
具体实施方式
bmgy培养基：酵母粉10gl–1，蛋白胨20gl–1，丙三醇10mll–1，100mm磷酸钾盐缓冲液，0.34％(质量百分数)无氨基酵母氮源(ynb)，1％(nh4)2so4，4x10–5％生物素，ph＝6.0。
硫酸软骨素水解酶酶活测定方法：300μl底物肝素(hp)-荧光素fitc、硫酸软骨素a(csa-荧光素fitc)、硫酸软骨素c(csc-荧光素fitc)(2mg·ml-1)，加入100μl发酵液，37℃水解1h，使用hplc的荧光检测器检测酶活。
实施例1：含硫酸软骨素水解酶基因毕赤酵母重组菌的构建
一种产硫酸软骨素水解酶的基因工程菌的构建，是以毕赤酵母为宿主，以ppic9k为载体，克隆所述硫酸软骨素水解酶基因(核苷酸序列如seqidno.1所示)，基因atg后添加6-his标签。上游引物引入ecori限制性酶切位点；下游引物引入noti限制性酶切位点；基因cshydro、质粒ppic9k经限制性内切酶ecori、noti酶切纯化后，16℃过夜连接转入escherichiacolijm109进行扩增，挑选测序正确的质粒转入pichiapastorisgs115进行表达，得到产硫酸软骨素水解酶的基因工程菌pichiapastorisgs115/ppic9k-chase。所述上、下游引物为：
f:ccggaattcatgcatcaccatcacca(seqidno:3)
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采用类似的方法，在核苷酸序列如seqidno.5所示的基因(ncbi上登录号为-nm_001008413.3)atg后添加6-his标签，然后克隆到ppic9k中，挑选测序正确的质粒转化到pichiapastorisgs115中进行表达，得到重组菌pichiapastorisgs115/ppic9k-chaseq。
实施例2：摇瓶水平发酵生产硫酸软骨素水解酶
以含有重组硫酸软骨素水解酶基因的重组毕赤酵母pichiapastorisgs115/ppic9k-chase为生产菌株，单菌落接种于ypd培养基中28℃，200rmp条件下培养过夜，得到种子培养液；将种子培养液按质量百分比2％的接种量接种到25ml的bmgy培养基，在培养基中加入1％的甲醇进行诱导，诱导温度28℃，诱导表达70h。发酵结束后，从图2可以看出，a为对照，b为用发酵液上清处理后的效果，主峰后移，对肝素hp有水解效果；从图3可以看出，a为对照，b为用发酵液上清处理后的效果，主峰后移，对csa(硫酸软骨素a)有水解效果；从图4可以看出，a为对照，b为用发酵液上清处理后的效果，主峰后移，对csc(硫酸软骨素c)有水解效果。测定对底物fitc-hp、csa-fitc、csc-fitc酶活为300fi/ml、500fi/ml、450fi/ml。
对照：重组菌pichiapastorisgs115/ppic9k-chaseq采用相同的方法进行发酵培养，对肝素、硫酸软骨素均没有活性。
实施例3：发酵罐水平发酵生产硫酸软骨素水解酶酶
将摇瓶培养的ypd种子液以10％的接种量接种于3l全自动发酵罐(liflusgmbiotron,korea)中，温度控制在30℃，使用25％氨水调节ph为5.5，初始搅拌转速为500r·min-1，通气量为2.5l·min-1，溶氧维持在30％以上。培养大约28h，od600约70-80待甘油耗尽，指数流加50％(w·v-1)甘油溶液(含12ml·l-1ptm1)，搅拌转速与溶氧相关联，控制转速在500-1000r·min-1补料12h，停止补料待甘油再次耗尽，od600约250(干重约60.0g·l-1)，转速在1000r·min-1并流加100％甲醇(含12ml·l-1ptm1)，甲醇浓度控制在18.0g·l-1，诱导温度分别采用30℃，25℃，22℃及阶段控制温度诱导策略，96h发酵酶活最高是摇瓶水平的5.5倍，测定对底物fitc-hp、csa-fitc、csc-fitc酶活为1650fi/ml、2750fi/ml、2475fi/ml。
实施例4：重组硫酸软骨素水解酶的纯化制备
纯化重组硫酸软骨素水解酶，具体步骤：使用5ml的ni柱，用磷酸盐缓冲液(50mmol·l-1ph7.0)平衡柱子10柱体积。4℃离心收集发酵上清液，上样20ml。采用咪唑梯度洗脱，咪唑用上述磷酸缓冲液配制，按照10mmol·l-1，30mmol·l-1，200mmo·l-1梯度洗脱，最后洗脱下来的是目的蛋白。洗脱下来的目的蛋白进行脱盐脱咪唑，4℃保存。经纯化后的酶活：对hp酶活650fi/ml。如图5，sds-page所示，泳道1表示发酵液上清中硫酸软骨素水解酶、泳道2表示纯化后硫酸软骨素水解酶的条带。
实施例5：酶性质测定
一系列ph值(4.0-11.0)的溶液用来测定硫酸软骨素水解酶的最适反应ph，分别是醋酸钠缓冲液(20mm，ph4.0-5.0)、磷酸缓冲液(20mm，ph5.0-7.0)、tris-hcl缓冲液(20mm，ph7.0-9.0)和gly-naoh缓冲液(20mm，ph9.0-11.0)，测得最适ph4.5。而不同温度对硫酸软骨素水解酶活性的影响测定主要是采用温度范围20℃-70℃，测得最适温度为37℃。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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