本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柑桔溃疡病感病基因cs9g12620.1、启动子及其编码蛋白。
背景技术
柑橘是重要的热带、亚热带果树，全世界有145个国家生产柑橘，生产分布十分广泛，产量居世界水果之首。目前，由柑橘黄单胞菌（xanthomonascitrisubsp.citri）引起的柑橘溃疡病是柑橘上为害最为严重的病害之一，其为害后，在柑橘叶、枝和果实上形成火山口状的病斑，严重时引起落叶、落果，树势衰退，直接影响柑橘的生长结果，特别是果实感病后，失去鲜销商品价值。由于病原菌可以随果实传播，因此被30多个国家和地区定为植物检疫对象。
柑橘黄单胞菌（xcc）在与寄主植物互作过程中,由iii型分泌系统（typeⅲsecretionsystem，t3ss），将细菌的效应蛋白（effectorproteins）注射进入寄主植物细胞，引起病原菌在寄主植物上的致病性。这些效应蛋白能够调节寄主细胞的功能，破坏寄主细胞正常的生理代谢功能，以及调控对寄主的吸附、侵染、定殖、扩展和最终显症等过程。在已报道的xcc的效应蛋白中，ptha4是xcc在柑橘上引起病害发生的关键毒性因子，此基因突变后的病原菌不能在柑橘上引起溃疡病害的发生；且在柑橘寄主上单独诱导ptha4基因可产生溃疡症状。ptha4属黄单胞菌avrbs3/ptha家族成员，是具有转录激活活性的效应蛋白（transcriptionactivatorlikeeffector，tale），经iii型分泌系统进入柑橘植物细胞后，依赖34个氨基酸串联重复单元中的12和13位可变位点与寄主基因启动子dna序列识别，类似于真核生物转录因子激活植物基因的表达。依据tale与寄主靶基因识别的分子密码，两家实验室先后报道了溃疡病菌ptha4蛋白在柑橘中识别并诱导表达了感病基因cslob1。
防治柑橘溃疡病的措施有很多，主要是以化学防治为主，农业防治为辅，但是在流行年份此病害仍然不能得到有效控制，因此，培育柑橘抗病品种是控制柑桔溃疡病的有效策略。由于转基因植物的安全释放上仍受到严格限制，因此，利用基因编辑技术对柑桔溃疡病菌的感病基因序列进行修饰，是目前较为合理的选择，如，运用crispr/cas9技术对cslob1及其启动子序列进行修饰，也确实可以减轻溃疡病的发生。
技术实现要素：
本发明的目的是为柑橘溃疡病的防治提供线索与理论基础，为获得抗病柑橘新品种提供科学线索，为基于基因编辑技术提供一种柑橘溃疡病新的感病基因cs9g12620.1作为靶点基因。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的是柑橘的cs9g12620.1基因，其编码的蛋白产物为细胞分裂后期促进复合物，其启动子能被柑橘溃疡菌主效效应蛋白ptha4识别。该基因被激活后过量表达，可直接导致柑橘溃疡病的发生。cs9g12620.1是此基因在citrussinensisannotationproject网站（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）上的编号，其启动子及其开放阅读框（orf）序列如seqidno.1所示，序列总长度为2439bp。该序列前1317bp部分为启动子，其序列如seqidno.1所示，在柑橘中编码373个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。启动子中能被ptha4特定识别的序列如seqidno.3所示，序列长度为19bp。
本发明的cs9g12620.1基因及其启动子被ptha4识别的片段由以下方法获得。
将健康的柑橘叶片和注射接种柑橘溃疡病菌的叶片，若干天后收集一定量的叶片，提取总rna并反转录成cdna，分别进行转录组学分析。将得到的表达水平显著上调的基因，在citrussinensisannotationproject网站中搜索获得其启动子序列，根据tale-dna互作识别的分子密码，获得潜在的靶基因，其中包括cs9g12620.1基因。将纯化蛋白ptha4与cs9g12620.1基因的启动子区域特异性识别序列进行凝胶阻滞（emsa）实验，证明ptha4可以与cs9g12620.1基因的启动子区域特异性识别序列结合识别；将cs9g12620.1基因上游1281bp的序列构建到具有gus报道基因的载体上，利用农杆菌瞬时表达方法，检测得到cs9g12620.1基因启动子可以被ptha4激活；在柑橘寄主上分别单独诱导ptha4基因和cs9g12620.1基因，可以产生相同的表型，即溃疡的症状。
本发明的优点在于：
本发明获得了柑橘中与柑橘溃疡病菌互作的感病基因cs9g12620.1系首次报道，并得到了被柑橘溃疡病菌ptha4蛋白识别的dna序列，此序列也为首次报道。该感病基因的获得，为运用分子遗传学方法改良柑橘品种提供了资源，具有极大的应用价值。cs9g12620.1基因的序列可在citrussinensisannotationproject网站（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）上查询得到。涉及ptha4（nc_020800.1）的序列可以在ncbi数据库中查询（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
附图说明
图1是柑橘cs9g12620.1基因启动子被ptha4蛋白结合的dna序列位置图（下划线部分序列），其中红色部分为cs9g12620.1的翻译起始密码。
图2是柑橘溃疡病菌ptha4蛋白与cs9g12620.1基因启动子特定序列结合。
图3是柑橘溃疡病菌ptha4蛋白激活cs9g12620.1基因启动子。
图4是cs9g12620.1基因过量表达导致柑橘溃疡症状。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
柑橘溃疡病菌ptha4蛋白与cs9g12620.1基因启动子特定序列的识别
本实施例纯化柑橘溃疡病菌ptha4蛋白，并人工合成cs9g12620.1基因启动子中预测的uptbox，通过凝胶阻滞（emsa）实验，证明了cs9g12620.1基因启动子中的uptbox与ptha4互作结合。以烟草基因组作为模板，设计引物5’-tgccatggatccatgagaggaggattgtggca-3’和5’-ccgagctcagctcctagacctgttaaccga-3’进行pcr扩增aminomethyltransferase基因片段，pcr产物回收后用ncoi-saci酶分别对pcr产物和原核表达载体pet32a进行酶切。aminomethyltransferase基因片段连接进入pet32a(+)，该重组质粒用bamhi处理酶切以后，与从pufr034:ptha4质粒上用bamhi切下的ptha4片段连接。得到的重组质粒载体经酶切验证后送公司测序，确定连接片段正确。本构建策略没有先行连接的小片段切除，但不影响ptha4与pet32a(+)的融合表达，ptha4序列经bamhi酶切后的3’端序列最后2个碱基cc，正好与将与aminomethyltransferase基因片段5’端序列-atga-顺读，出现终止密码子，提前终止翻译。测序验证正确后，再将其质粒转入到大肠杆菌bl21（de3）里。根据分子克隆实验手册中的iptg诱导原核纯化表达方法，纯化出蛋白ptha4。对cs9g12620.1基因启动子中预测的能被ptha4识别的特定序列进行人工合成，并利用thermo公司的biotin3’enddnalabelingkit（89818）对此序列进行生物素标记。将标记好的片段和纯化的蛋白ptha4利用thermo公司的lightshifttmemsaoptimization&controlkit（20148ⅹ）试剂盒方法进行emsa实验，利用thermo公司的chemiuminescentnucleicaciddetectionmodule（89880）进行显色，结果显示ptha4可以与cs9g12620.1基因启动子中的特定序列结合（参见图2），证明了cs9g12620.1基因是ptha4的靶基因。
实施例2
柑橘溃疡病菌ptha4蛋白转录激活cs9g12620.1基因
本实施例将cs9g12620.1基因上游序列构建到具有gus报道基因的载体上，利用农杆菌瞬时表达方法，证明cs9g12620.1基因启动子可以被ptha4激活。以柑橘基因组为模板，设计引物5’-tcgaattcgactaagactttgggggcat-3’和5’-tcggatcctgatgaagcaactaggatgaata-3’，克隆cs9g12620.1基因的启动子序列到携带gus报道基因的植物双元表达载体pcambia1381中；以pufr034:ptha4质粒为模板，设计引物5’-tgcaagcttatggatcccattcgttcgcgcaca-3’和5’-ccatgcatgcactgcctccactg-3’克隆带有酶切位点hindiii和sphi的ptha4基因5’端828bp片段、设计引物5’-tttgcatgcattcgccgattcgct-3’和5’-tgctctagatcactgaggcaatagctccat-3’克隆带有酶切位点sphi和xbai的ptha4基因3’端380bp片段，将这两片段分别用hindiii和sphi、sphi和xbai酶切后，连接到用hindiii和xbai酶切后的phb载体上得到重组质粒，用bamhi分别酶切此重组质粒和pufr034:ptha4质粒，分别回收重组质粒中切下的带bamhi的phb载体和pufr034:ptha4质粒酶切下的5’和3’端均带有bamhi的ptha4部分片段，并将两酶切产物连接，构建成phb：ptha4质粒。将pcambia1381：cs9g12620.1和phb：ptha4质粒分别转化农杆菌gv3101；将2株农杆菌分别组合，共同注射烟草植物叶片，以单独注射携带启动子构建的农杆菌处理为对照，根据(hu,y.,zhang,j.,jia,h.,sosso,d.,li,t.,frommer,w.b.,yang,b.,white,f.f.,wang,n.,andjones,j.b.2014.lateralorganboundaries1isadiseasesusceptibilitygeneforcitrusbacterialcankerdisease.proc.natl.acad.sci.usa111,e521-529.)的方法，检测结果显示gus活性被ptha4蛋白诱导显著增强（见图3），证明ptha4激活cs9g12620.1基因启动子并转录。
实施例3
在柑橘叶片上过量诱导cs9g12620.1基因产生溃疡症状。
本实施例在寄主柑橘叶片上过量诱导在柑橘寄主上分别单独诱导ptha4基因和cs9g12620.1基因，均可以产生溃疡的症状。以柑橘基因组为模板，设计引物5’-tgctgcagatggcttggtttctctctctt-3’和5’-tcgagctcctatcggagaggaagaacactaa-3’，克隆cs9g12620.1基因到植物双元表达载体phb；将得到的重组质粒与实施例2中的phb：ptha4分别转化农杆菌gv3101；将得到的农杆菌分别在柑橘叶片上注射接种，4天后，接种叶均出现溃疡症状（见图4）。证明，该基因的过量表达可以直接导致柑橘发生柑橘溃疡病，这为防治柑橘溃疡病提供了极大的应用前景。
产业上的可利用性
培育柑橘抗病品种是控制柑橘溃疡病的有效策略，采用基因编辑手段对cs9g12620.1启动子区中能与ptha4结合的序列进行修饰，提高柑橘对溃疡病的抗性，在柑橘产业的抗病育种中的有着极大的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
sequencelisting
<110>福建农林大学
<120>柑橘溃疡病感病基因cs9g12620.1
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