本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥基因par3(g311e)的应用，还涉及拟南芥基因par3(g311e)的克隆、转基因载体构建、转基因、表达检测及表型分析。par3(g311e)是par3基因的cds序列第932位脱氧鸟苷酸突变为脱氧腺苷酸，导致par3所编码的蛋白质第311位甘氨酸变为谷氨酸所致，突变后的蛋白质被称为par3(g311e)。par3(g311e)基因可用于提高植物对除草剂百草枯的耐受性，也可作为转基因筛选标记在构建转基因载体时应用。
背景技术
农作物在田间生长，杂草会竞争吸收土壤中的营养和水分，影响作物的生长状态和种子产量，因此耕作者必须耗费大量的时间和人力成本来除去田间滋生的杂草。除草剂发明以后，耕作者在田间除草上花费的人力大大减少。除草剂可以分为选择性除草剂和灭生性除草剂。选择性除草剂对不同种类的植物作用程度不同，它可以杀死部分杂草，而对作物无害。灭生性除草剂则对所有植物都有毒性，一般靶点为植物光合作用系统或者蛋白质合成机器，导致植物死亡，常用的灭生性除草剂有百草枯、草甘膦等。基因工程育种技术诞生以后，灭生性除草剂由于防治杂草种类较为广泛而被广为使用。育种公司通过将抗除草剂基因转入农作物体内，育成抗除草剂作物，在田间种植时只需要定期喷洒除草剂，就可以除去杂草，而作物则因为带有抗性而被保留。除草剂的使用使得作物大规模种植变得方便，不再需要耗费大量人力手工拔除杂草。该技术的瓶颈是寻找可用的抗除草剂基因。寻找抗除草剂基因，并将它们转入作物体内，可育成新的抗除草剂作物。
百草枯（1,1-二甲基-4,4二氯联吡啶化合物，paraquat，pq），学名甲基紫精（methylvilogen,mv），是一种使用极其广泛的广谱接触性非选择性除草剂(haley,1979)，在光照情况下，它能够接受叶绿体psⅰ中的电子并传递给分子氧导致体内产生ros从而造成严重的氧化胁迫(bonneh-barkayetal.,2005)。百草枯已有50多年的使用历史，能够快速杀死与它接触后的一年生和多年生的杂草，并被广泛应用于果园、茶园以及其它农作物种植中，极大促进了农耕业的发展。
我们在筛选拟南芥抗百草枯突变体时，发现一株突变体par3在含百草枯的平板上具有很强的抗性。对突变基因进行定位，发现它是由于par3基因突变引起。该基因编码的蛋白属于mate(multidrugandtoxiccompoundextrusion)家族的成员，分子内第311位甘氨酸突变成为谷氨酸导致了拟南芥对百草枯的抗性。par3定位于液泡膜或者细胞膜上，由483个氨基酸组成，具有12个跨膜结构域，它的突变蛋白par3(g311e)的亚细胞定位并未发生改变，但向液泡内或者细胞外转运百草枯的能力增强。在植物或者微生物中人为地增加par3(g311e)基因的表达量，可以增强宿主对百草枯的耐受能力。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种可用于改造植物或其它物种对百草枯耐受性的膜蛋白基因par3(g311e)，该基因具有增强宿主抗百草枯活性的能力。将该基因通过转基因手段转入植物或者微生物中，筛选过表达株系，可以得到抗百草枯能力增强的物种。
本发明在拟南芥和酵母中人为地过量表达par3(g311e)能够增强宿主对除草剂百草枯的耐受性，使它们在除草剂处理情况下能够存活。具体是在含有百草枯的培养基上，与野生型相比，过表达par3(g311e)的转基因株系能够存活长大而非转基因的对照植物则因叶片发黄而枯死；过表达par3(g311e)的转基因酵母也比不表达par3(g311e)的酵母在百草枯存在的情况下生长状态更好。本发明提供的基因能够增强植物应对除草剂百草枯胁迫的能力，降低农作物在百草枯处理下的产量损失，并且可以作为进行转基因操作时转基因株系的筛选标记，具有实际应用价值。
本发明首先提供拟南芥par33(g311e)基因的核苷酸序列，如seqidno.1所示。其cdna全长1661bp，开放阅读框1452bp（黑色加粗标记），par3(g311e)dna顺序为野生型par3基因cds区域第932位脱氧鸟苷酸突变成为脱氧腺苷酸（黑色字体标记），导致编码的蛋白质氨基酸顺序发生改变而来。par3(g311e)蛋白一共含有483个氨基酸，为野生型par3蛋白第311位甘氨酸突变成为谷氨酸而来（突变位点黑色加粗标记），如seqidno.2所示。par3突变体中par3野生型蛋白突变成为par3(g311e)，从而使得植物带有了百草枯抗性。
本发明还提供分别从拟南芥野生型和par3突变体中扩增野生型及突变基因的cds全长的引物序列，具体为：
上游引物（kpni）：cggggtaccatggaagatccacttttattggg（seqidno.3）
下游引物（bamhi）：cgcggatcctcaagcaagtccattgccaa（seqidno.4）。
本发明还提供含上述拟南芥par3(g311e)基因的载体。即利用par3(g311e)抗百草枯功能构建的转基因载体，具体是将该突变基因连接入转基因载体，例如植物转基因载体的35s启动子之后，代替抗生素作为转基因植物的筛选标记，转基因株系获得了对百草枯的抗性，在含有百草枯的平板上可以被筛选出来。
本发明还提供含上述par3(g311e)基因载体的宿主。优选地，宿主为植物或者微生物。
本发明还提供上述par3(g311e)基因在增强宿主抗百草枯活性方面的应用，具体步骤为：
（1）将拟南芥par3(g311e)的全长cds连入植物过表达载体中，获得含par3(g311e)基因的植物过表达载体；如pcam-n-eyfp中；
（2）将含par3(g311e)基因的植物过表达载体转入农杆菌gv3101中，鉴定为阳性的农杆菌用于侵染植物，经过收种、潮霉素筛选等转基因实验，获得表达par3(g311e)的转基因株系；
（3）将已鉴定得到的表达par3(g311e)的转基因株系的种子撒播在含有百草枯的培养基上，发现转基因株系具有明显的抗百草枯的能力，植株正常生长，而对照则不能生长。
本发明还提供利用荧光定量pcr技术检测拟南芥中par3组织表达特异性的方法，具体步骤为：在液氮中研磨拟南芥各组织后，用trizol法抽提拟南芥总rna，用dnasei消化dna杂质后，反转录得到cdna，以此为模板通过荧光定量pcr进行分析，以野生型为对照。荧光定量pcr所需的引物序列为：
荧光定量pcr鉴定par3组织特异性的引物：
上游引物：gcaaatgtggtggcttactatc（seqidno.5）
下游引物：caccgatccatagccctttac（seqidno.6）
对照ubq5引物：
上游引物：aatgtgaaggcgaagatccaagac（seqidno.7）
下游引物：agacggaggacgagatgaagc（seqidno.8）。
本发明还提供将par3(g311e)连入酵母转基因载体并进行酵母转化的引物：
上游引物：acaagtttgtacaaaaaagcaggctctccaaccaccatgatggaagatc
cacttttattggg（seqidno.9）
下游引物：tccgccaccaccaaccactttgtacaagaaagctgggtaagcaagtcca
ttgccaaatga（seqidno.10）。
本发明所述par3(g311e)基因，可用于培育抗百草枯功能的转基因植物，即根据par3(g311e)基因的功能，利用转基因手段将par3(g311e)转入植物中。
所述植物包括农作物，例如烟草、大豆、水稻、玉米等。
本发明具有以下优点及意义：
本发明提供的拟南芥par3(g311e)基因及其编码蛋白在提高植物和微生物对百草枯耐受性方面具有明显作用，具有很强的应用价值；也可以用于植物和微生物中转基因实验中的筛选标记，用于筛选转基因阳性株。
附图说明
图1为par3突变体对百草枯抗性分析，表现出强烈抗性。其中，a.正常1/2ms平板；b.含0.8μmol/l百草枯的1/2ms平板；c.正常及0.8μmol/l百草枯平板上幼苗根长统计(**students’t-test,p<0.01.)。
图2为par3突变体的显隐性分析。其中，a,b均为0.8μmol/l百草枯平板，a.0.8μmol/lpq平板；b.0.8μmol/lpq平板。
图3为par3蛋白二级结构预测。a.par3蛋白是一个具有12个跨膜结构域的膜蛋白，箭头表示突变位点在第八个跨膜结构域末端；b.预测蛋白跨膜结构域的一级序列，圆圈表示第311位突变位置。
图4表明par3突变体在百草枯平板上体内活性氧水平比野生型更低。比例尺=0.5mm。
图5为par3基因在各个组织中的表达水平比较。
图6显示过表达par3(g311e)的转基因植物对百草枯具有抗性。其中，a.拟南芥转基因株系对百草枯的表型。平板中含有0.8μmol/l百草枯。每种转基因株系显示表达水平不同的3个代表性转基因株系，图中可见表达突变蛋白yfp-par3(g311e)的转基因株系抗百草枯，而表达野生型（yfp-par3）蛋白的转基因株系抗性不明显。b.左图中pro35s::yfp-par3(g311e)转基因株系中突变基因的表达水平。
图7表明酵母中表达par3(g311e)可以增强酵母抗百草枯的能力。其中，a.正常1/2ms平板；b.2μmol/l百草枯平板；c.正常生长条件；d.2μmol/l百草枯条件；e：westernblot鉴定各酵母中蛋白表达情况，抗体：anti-ha。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法均按照常规条件，例如sambrook等著的《分子克隆》实验手册，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1，par3突变体对百草枯表现出强烈抗性
将col-0和par3(g311e)种子装入干净灭菌后的离心管，加入70%乙醇旋转灭菌10min，之后换用含有0.01%tritonx-100的无水乙醇，振荡几次后置于灭菌的干净滤纸上，待乙醇挥发后，点播或均匀撒在正常1/2ms培养基和0.8μmol/l培养基上。4℃避光处理2~3d，转移至长日照人工箱（22±2）℃条件下进行培养，l/d光强150μmol/m2s，湿度为50%，14d后观察表型并统计根长，见图1。突变体par3的根长明显长于col-0，表现出较强的百草枯抗性表型。
实施例2，par3突变体的显隐性分析
为了确定par3突变体的显隐性，将par3与col-0进行回交并将得到的f1和f2代种子点播在含有0.8μmol/lmv的1/2ms培养基上，培养14d后进行拍照。回交得到杂合子表现抗mv但表型要比纯合突变体要弱，故认为突变为显性，且杂合子表现半显性，如图2a。回交f2代中对抗mv的强表型/弱表型/无表型植株数目比值为1/2/1，如图2b。这说明par3是一个显性单基因突变，基因组中单个突变拷贝就会使拟南芥具有抗百草枯的表型。进一步通过杂交定位和深度测序技术，发现该突变体的表型是由于par3基因编码区顺序第932位的g变成a引起。par3基因属于mate(multidrugandtoxiccompoundextrusion)基因家族的成员，目前在体内的功能还是未知的。
实施例3，par3蛋白二级结构预测
利用phyre2蛋白折叠识别在线服务器（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgiid=index）对par3蛋白进行预测，得到par3（g311e）的二级结构，其模板为na+结合的外运蛋白，pbd号为c3mkub(预测coverage：93%，预测confidence：100%)，预测得到的par3蛋白是一个具有12个跨膜结构域的膜结合蛋白，par3的突变位点发生在第八个跨膜结构域的末端，结构模拟图如图3所示。
实施例4，par3突变体在百草枯平板上体内活性氧水平比野生型更低
dab可以染色植物体内活性氧成分。将生长在正常平板以及含0.3μmol/l百草枯平板上的幼苗（10d）进行dab染色后拍照（图4），可以观察到正常情况下，col-0及par3只有在根中有少部分h2o2信号，而在0.3μmol/l百草枯平板上生长的幼苗，col-0在生长点以及根中有大量的h2o2积累；与此对照的是，par3突变体中未积累很明显的h2o2，表明par3突变体中表达的par3(g311e)使植物在百草枯平板上受到的氧化胁迫更少，从而生长状态更好。
实施例5，par3基因在拟南芥各组织中的表达情况
利用trizol法提取拟南芥各组织的rna（具体操作见takara公司trizol的说明书），反转录成为cdna（primescripttmrtreagentkit,takara），以cdna为模板进行real-time荧光定量分析（sybr
实施例6，过表达par3(g311e)的转基因植物对百草枯具有抗性
1、par3(g311e)基因cds片段的克隆及序列分析
以拟南芥突变体par3(g311e)的幼叶为材料，利用trizol法提取rna（具体操作见takara公司trizol的说明书），经dnasei处理后除去dna（具体操作见takara公司dnasei的说明书），反转录成cdna（具体操作见takara公司primescripttmreversetranscriptase的说明书）。根据tair(www.arabidopsis.org)网站上拟南芥数据库信息中提供的序列信息，设计引物（seqidno.3），采用rt-pcr方法，以上述反转录所得的cdna为模板进行cds全长克隆。通过rt-pcr得到一个包含有完整开放阅读框的编码区片段，长度为1452bp，将其连接到pcr-blunt载体上，进行测序。测序结果在ncbi网站上进行blast分析，得到的par3(g311e)与网站显示的野生型par3基因序列有一个碱基的差别。par3(g311e)全长编码区的长度为1452bp，其序列如seqidno.1所示。根据全长cds推导出水稻par3(g311e)的氨基酸序列，共483个氨基酸残基，分子量为51932.5道尔顿，等电点（pi）为7.5987，其序列如seqno.2所示。预测显示此蛋白为12次跨膜的蛋白质。
2、拟南芥野生型par3和突变基因par3(g311e)的转拟南芥过表达载体构建：
将par3和par3(g311e)基因cdna全长连入过表达载体pcam-n-eyfp（kpni、bamhi位点之间）中，测序确定顺序正确后，将该过表达载体转入农杆菌gv3101中，并转化模式植物拟南芥（col-0生态型）。
3、农杆菌介导法进行拟南芥转基因：
a．种植columbia-0生态型拟南芥
拟南芥培养土成分：蛭石/黑土/珍珠岩为9/3/1。
将土装满盆子，盘底部浇入营养液并充分浸湿，将col-0种子点种在土中，每个小盆种植4株拟南芥，保鲜膜覆盖，置于4℃下低温处理打破休眠，2~3d后移入长日照温室中，（22±2）℃进行培养。保持土壤半干半湿状态。在开花前再浇一次营养液。
b．转化农杆菌
从-70℃冰箱取出gv3101感受态细胞置于冰上融化，将5μl载体质粒加入感受态细胞中，枪头搅拌轻轻混匀。冰上放置5min，在液氮中冷冻5min，37℃热激5min，加入1mldyt培养基。28℃，100r/min振荡培养4h。室温5000×g离心2min，留约100μl上清，枪头吹打悬浮菌体，涂布在相应固体筛选培养基上，其中gv3101菌抗性为庆大霉素和利福平，pcam-n-eyfp质粒抗性为卡那霉素。28℃倒置培养36~48h，挑取若干单克隆进行菌落pcr鉴定阳性菌落。
c．浸花法转化拟南芥
转基因前一天，剪掉植物果荚及开放的花。将已转化相应质粒的农杆菌单菌落接入3ml带相应抗性的dyt液体培养基，28˚c、220r/min摇床培养过夜。将菌液1:50转接到100ml含相同抗性dyt液体培养基中，继续培养至od6001.0~1.5。室温5000×g离心15min收集菌体，拟南芥转化溶液重悬至od600=0.8；将植物的花序浸泡在转化溶液中5~10min。转化过的植物避光处理24h，培养至收获种子。
4、转基因拟南芥的筛选
收获成熟的t0代种子撒播于含有潮霉素抗性的1/2ms固体培养基上，4℃避光处理2~3d，移入光照培养箱。挑选抗性平板上萌发并能长出绿色子叶、具有较长根的阳性苗，移栽入土，收集叶片通过qrt-pcr实验鉴定过表达株系，然后收获par3和par3(g311e)过表达株系t1代转基因种子。
5、过表达par3和par3(g311e)转基因植株对百草枯的表型
将par3和par3(g311e)转基因植株种子装入干净灭菌后的离心管，同时用转入pcam-n-eyfp空载体的转基因植株作为对照，加入70%乙醇旋转灭菌10min，之后换用含有0.01%tritonx-100的无水乙醇，振荡几次后置于灭菌的干净滤纸上，待乙醇挥发后，点播于0.8μmol/l的百草枯培养基上。4℃避光处理2~3d，转移至长日照人工箱（22±2）℃条件下进行培养，l/d光强150μmol/m2s，湿度为50%，14d后观察表型，见图6，过表达突变基因par3(g311e)的转基因植株表现出很强的抗百草枯的表型，而过表达野生型基因却未表现出相应的表型。
实施例7，在酵母中表达par3(g311e)可以增强酵母抗百草枯的能力
par3(g311e)基因的转酵母表达载体构建：
用seqidno.5所示的引物对实施例6中所得到的带有par3和par3(g311e)的pcr-blunt质粒进行扩增，获得par3和par3(g311e)cdna全长后连入到表达载体pnxgate-32-3ha上，测序正确后将该表达载体转入酵母thy.ap5中。
1、酵母转化
将于-70℃保存的thy.ap5酵母菌三区划线于固体ypda培养基，28℃培养2~3d。挑取平板上的直径2~3mm单菌落，接种于液体ypda培养基中，250r/min、30℃培养过夜。将过夜培养的菌液转接至50ml液体ypda，初始od600调至0.2~0.3，250r/min、28℃培养3~4h。待菌体摇至od600=0.5左右，4℃1000×g离心5min收集菌体，用无菌水重悬菌体，4℃1000×g离心5min收集菌体。0.1mmol/lliac重悬酵母，4℃1000×g离心5min收集菌体，0.1mmol/lliac重悬后分装至灭菌后的ep管，75μl每管，每管加入240μl50%peg、36μl0.1mmol/lliac、10μl单链鲑鱼精dna以及10μl待转化质粒，将上述体系混合均匀，220r/min、30℃振荡培养30min，然后取出于42℃水浴25min，期间颠倒混匀5次，30℃水浴复苏1~2h，1000×g离心5min收集菌体，生理盐水重悬菌体，并涂布在sd/trp培养基上。
2、观察酵母对百草枯的表型
（1）挑取酵母单菌落，并接入3ml的sd/trp培养液中，250r/min、30℃摇过夜后，用生理盐水将酵母稀释至od600为0.5，并依次稀释成不同梯度，取5μl点样在对照和0.8μmol/l的百草枯平板上。
（2）挑取酵母单菌落，并接入3ml的sd/trp培养液中，250r/min、30℃摇过夜后，用生理盐水将酵母稀释至od600为0.2，并再次稀释10倍，250r/min、30℃培养，前32h每隔8h测量依次od600，之后每隔12h测依次。
表达par3(g311e)的酵母在平板上以及液体培养基中均表现出对百草枯的抗性，大大强于其野生型基因的转基因酵母，如图7所示。
综上所述，通过过表达par3(g311e)基因，可以增强植物和酵母对百草枯的耐受性。因此，par3(g311e)基因在通过基因工程手段改善作物和微生物对百草枯抗性上具有很好的应用前景。
sequencelisting
<110>复旦大学
<120>一种抗除草剂基因par3(g311e)的应用
<130>001
<160>10
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1661
<212>dna
<213>下述序列为par3(g311e)基因序列，下标核苷酸表示par3(g311e)基因的突变位点，野生型par3基因中的脱氧鸟苷酸突变成为脱氧腺苷酸（g→a），导致编码蛋白的第311位甘氨酸（g）变成谷氨酸（e）
<400>1
gaagtcgtgcattctcatctcacacgttccaaggtcaagaaaggatcgttgacaagaact60
aaagatctccaagaagataatggaagatccacttttattgggagacaatcagataatcac120
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gtttataaaaaaatatgataaaattttaaacttaactagta1661
<210>2
<211>483
<212>prt
<213>par3(g311e)基因编码的蛋白质氨基酸序列。野生型基因突变导致编码蛋白的第311位甘氨酸（g）变成谷氨酸（e），下标位点为突变位点。
<400>2
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