本发明属于分子生物学和生物技术领域，更加具体地说，涉及一种盐芥耐低磷基因及应用。
背景技术
磷是生物生长发育的重要营养元素之一，是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小分子的重要组成成分，在植物新陈代谢过程中扮演着十分重要的角色。然而，磷是一种不可再生的资源，大部分土壤有效磷含量较低，难以满足植物生长的正常需求。据报道，世界上至少有30％～40％的作物产量受到低磷胁迫的严重抑制(runge-metzgera.)。农业生产上，主要通过施用磷肥来解决土壤磷缺乏问题，但是使用的磷肥很容易被土壤固定为作物不易吸收的难溶性磷，难以完全满足作物对磷的需求。因此，提高植物对磷的吸收和利用率，创制耐低磷作物品种，对于减少农业磷的施用量，维护生态安全，提高作物的产量等方面具有重要意义。
目前，亟需一种耐低磷基因用于培育耐低磷作物。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种盐芥耐低磷基因。
本发明的第二个目的是提供一种含盐芥耐低磷基因的重组载体。
本发明的第三个目的是提供一种含上述重组载体的宿主细胞。
本发明的第四个目的是提供一种盐芥耐低磷基因提高植物耐低磷性能的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种盐芥耐低磷基因thpht1-8，所述基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
含盐芥耐低磷基因thpht1-8的重组载体。
含上述重组载体的宿主细胞。
一种盐芥耐低磷基因thpht1-8提高植物耐低磷性能的应用。
本发明的盐芥耐低磷基因thpht1-8，从盐芥中获取，采用该基因转染的拟南芥表现出对低磷胁迫的耐受力，说明本发明提供的耐低磷基因thpht1-8在改良作物耐低磷的能力方面，起着重要的作用。
附图说明
图1是本发明的盐芥耐低磷thpht1-8基因克隆电泳示意图。
图2是包含盐芥耐低磷的基因thpht1-8的表达载体示意图。
图3是pcambia3301_thpht1-8转化农杆菌c58pcr筛选结果。
图4是thpht1-8转基因拟南芥t3纯合体半定量pcr结果。
图5是thpht1-8转基因拟南芥t3纯合体耐低磷根系实验效果。
具体实施方式
本发明中涉及到的实验材料、所用试剂来源如下：
盐芥(eutremasalsugineum)：由中国科学院植物所李银心教授带领，采自北京大兴区盐渍化的农田边。
pjet1.2：购自赛默飞公司http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.html
pdonr201:购自赛默飞公司http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.html
pcambia3301:购自赛默飞公司http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.html
dh5α感受态细胞，反转录试剂盒：购自北京北京全式金生物技术有限公司，http://www.transgen.com.cn/shop.html。
胶回收试剂盒：购自宝生物工程公司，http://www.takara.com.cn/。
农杆菌菌株c58：购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com。
本发明中涉及到的反应体系：
bp反应：
attb-pcr1ul
pdonr2010.5ul
1×tebuffer(ph8.0)to4ul
lr反应：
entryclone(100ng/ul)1ul
destinationvector(150ng/ul)0.5ul
1×tebuffer(ph8.0)2.5ul
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种盐芥耐低磷基因的获得
首先，以采自农田边的盐芥为原料，利用基因克隆技术，获取本发明的盐芥耐低磷thpht1-8基因。
取生长了五周的新鲜盐芥植株，使用植物rneasyplantminikit(transgenecode#ep101-0150rxns)提取totalrna，并且利用easyscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix(transgenecode#ae301-03100rxns)去除基因组dna干扰，反转录出cdna。
在phytozome和tair数据库中，找出拟南芥全部pht1基因(9个)，然后将这些atphts放入phytozome的盐芥数据库中进行检索。再利用获得的盐芥pht1基因，在phytozome再次检索，共找到14个盐芥pht1基因。
对thpht1s基因进行了蛋白全序列对比，绘制了盐芥与拟南芥pht1家族基因和系统发生树，将与atpht1-8亲缘关系最近的盐芥thhalv10009424m命名为thpht1-8，并进行基因克隆。本实验根据盐芥thpht1-8基因序列设计上游引物：pht-f(seqidno.2所示，5’-atgccaataaaggtattgtc-3’)和下游引物：pht-r(seqidno.3所示，5’-ttacccgtcaacaatctgtggct-3’)，以盐芥叶片cdna为模板，进行基因克隆，得到完整thpht1-8基因全长为2544bp，为本发明中所述盐芥耐低磷基因，见图1。pcr克隆产物连接进pjet1.2并测序，与数据库中thpht1-8cds(全长1578bp)比对，发现在cds序列的686bp和687bp之间多了966bp，thpht1-8基因如seqidno.1所示，重提盐芥叶片总rna，并用dnasei处理后克隆，克隆序列仍为2544bp。
实施例2
含盐芥耐低磷基因的重组载体pcambia3301_thpht1-8的构建
构建含有本发明的盐芥耐低磷基因的中间载体pjet1.2_thpht1-8、pdonr201_thpht1-8和植物表达载体pcambia3301_thpht1-8，见图2。
将胶回收纯化后的目的片段，纯化后的盐芥耐低磷基因(thpht1-8基因)，利用clonejetpcrcloningkit(clonejetpcrcloningkit#k123120rxns，thermo)进行pjet1.2_thpht1-8克隆载体的构建，并转化dh5α感受态细胞。
利用目的片段的上下游引物pht-f(seqidno.2)和pht-r(seqidno.3)对菌落进行pcr筛选，阳性菌送测序。提取测序正确菌液的质粒进行bp反应，筛选出阳性克隆(pdonr201_thpht1-8)，进行测序。
同时，提取测序正确的bp菌质粒进行lr反应，筛选出阳性克隆，将筛选出的阳性克隆扩大培养，提取质粒，转化c58感受态细胞。即盐芥耐低磷基因的植物表达载体pcambia3301_thpht1-8的构建。
实施例3
盐芥耐低磷基因thpht1-8在提高植物耐低磷性能方面的应用
利用实施例2筛选的pcambia3301_thpht1-8阳性表达载体(盐芥耐低磷基因的重组载体)利用电击法转化农杆菌c58感受态细胞，c58感受态细胞具有利福平抗性(rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(gen)。
将pcambia3301_thpht1-8转化c58后，挑选单菌落，用克隆引物进行菌落pcr，如图3所示，用1％的胶电泳，点样为5μl2×loadingbuffer+5μlpcr产物。条带大小为2544bp。最左侧条带为markerdl2000。pcr鉴定为阳性的菌落用以侵染拟南芥。
农杆菌的活化与扩大培养：挑保存的阳性农杆菌的单菌落置于3ml含相应抗生素的yeb液体培养基中gen(25μg/ml)；rif(10μg/ml)；草丁膦(50μg/ml)过夜培养15小时左右(至od600＝0.8左右)，170rpm，28℃。农杆菌的扩大培养：新鲜的10ml的yeb液体培养基中加入适量的抗生素(gen抗生素，浓度为25μg/ml；rif抗生素，浓度为10μg/ml；草丁膦抗生素，浓度为50μg/ml)，然后接种3ml上述所得农杆菌菌液，于50ml新鲜yeb液体培养基中进行培养，170rpm，在28℃培养至od600＝0.6。经培养得到含有一定数量重组载体的宿主细胞。
经过上述步骤筛选的阳性农杆菌(含有重组载体的宿主细胞)进行保存，挑保存的阳性农杆菌的单菌落过夜培养(至od600＝0.8左右)，菌液离心后弃上清，用5％的蔗糖液体重悬菌体后浸泡待转化的拟南芥的整个花序约30-45秒，取出拟南芥，使其横躺在托盘中，用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h，然后在温度25℃，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度：70％的培养条件下下使其正常生长，直到种子成熟。种子采集后放到37℃烘箱烘干两周，已备后续试验使用。
将收取的t1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃春化三天，然后在超净台上将已经春化好的拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml草丁膦的1/2ms固体筛选培养基上，在22-25℃，140μmol/(㎡·s)当转化植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤中，约一个半月后收集种子即为t2代转化种子。采用相同方法进行筛选，继续生长一代后得到t3代种子，通过在含草丁膦的1/2ms培养基上筛选，100％成活率的从种子即为t3代纯合体种子。
盐芥耐低磷基因转化拟南芥后，t3纯合体pcr测定表达水平结果，用克隆引物做半定量，检测基因的表达情况，部分结果如图4所示。选取表达水平高的2个独立转化株系和野生型拟南芥(wt)的种子同时无菌处理，平铺到1/2ms固体平板上，4℃春化两天，22℃光照培养箱萌发5天，然后移到低磷(50μmpi)培养基(1/2ms固体平板中磷的浓度为50μm)上垂直培养5天，观察其表型差异。如图5所示，在低磷处理条件下，转盐芥耐低磷基因拟南芥(thpht1-8)和野生型对照的根长有显著区别。
上述实验验证本发明的盐芥耐低磷基因具有耐低磷性能。实验的目的是验证上述基因具有耐低磷性能，将上述基因转到植物中，若在植物中能够表达，则该种植物具有耐低磷的特性。
实验证明，本发明的基因可以应用到的作物大豆、玉米、棉花中，并且具有耐低磷的特性。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>天津大学
<120>盐芥耐低磷基因thpht1-8及重组载体及应用
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