本发明涉及农学领域，具体地，涉及osexp10基因调控水稻生长以及对褐飞虱抗性的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球一半以上的人口以稻米为主粮。我国是人口大国，稻谷年产量和消耗量占世界总量的三分之一，因此，水稻的高产和优质直接关系到我国乃至全球的粮食安全。而病虫害一直是制约水稻产量和品质的重要因素之一，尤其是褐飞虱(brownplant-hopper,bph；nilaparvatalugens
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种osexp10基因调控水稻生长以及对褐飞虱抗性的应用。
本发明的第一方面提供了一种物质的用途，所述的物质选自下组：exp10基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的农艺性状，所述农艺性状选自下组的一种或多种：
(i)株高；
(ii)籽粒；
(iii)颖壳细胞的长度；
(iv)飞虱科昆虫的抗性；
(v)稻瘟病抗性。
在另一优选例中，所述的物质为exp10基因或其编码蛋白、或其促进剂，并且所述调控植物的农艺性状选自下组：
(i-1)增加株高；和/或
(ii-1)增加籽粒的大小；和/或
(iii-1)增加颖壳细胞的长度。
在另一优选例中，所述的物质为exp10基因的抑制剂，并且所述调控植物的农艺性状选自下组：
(i-2)降低株高；和/或
(ii-2)降低籽粒大小；和/或
(iii-2)缩短颖壳细胞的长度；和/或
(iv-2)具有飞虱科昆虫的抗性；和/或
(v-2)具有稻瘟病抗性。
在另一优选例中，所述飞虱科的昆虫选自下组：褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱、或其组合。
在另一优选例中，所述促进剂指促进exp10基因或其蛋白表达的物质。
在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述反义核酸包括sirna、shrna、和/或mirna。
在另一优选例中，所述的exp10基因包括cdna序列、基因组序列、或其组合。
在另一优选例中，所述exp10基因来自禾本科作物。
在另一优选例中，所述的exp10基因来自选自下组的一种或多种植物：水稻、小麦、玉米、高粱、或其组合。
在另一优选例中，所述exp10基因选自下组：水稻的exp10基因(xm_015781332.1)、小麦的exp10基因(ay543533.1)、玉米的exp13基因(nm_001138432)、高粱的exp10基因(xm_002446945.1)、或其组合。
在另一优选例中，所述exp10蛋白的氨基酸序列选自下组：
(i)具有seqidno.:1所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如seqidno.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控植物农艺性状功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与seqidno.:1所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述调控植物农艺性状功能的多肽。
在另一优选例中，所述exp10基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如seqidno.:1所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.:2所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；
(d)在seqidno.:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：杨柳科(salicaceae)、桑科(moraceae)、桃金娘科(myrtaceae)、石松科(lycopodiaceae)、(selaginellaceae)、银杏科(ginkgoaceae)、松科(pinaceae)、苏铁科(cycadaceae)、天南星科(araceae)、毛茛科(ranunculaceae)、悬铃木科(platanaceae)、榆科(ulmaceae)、胡桃科(juglandaceae)、桦科(betulaceae)、猕猴桃科(actinidiaceae)、锦葵科(malvaceae)、梧桐科(sterculiaceae)、椴树科(tiliaceae)、柽柳科(tamaricaceae)、蔷薇科(rosaceae)、景天科(crassulaceae)、苏木科(caesalpinaceae)、蝶形花科(fabaceae)、石榴科(punicaceae)、珙桐科(nyssaceae)、山茱萸科(cornaceae)、八角枫科(alangiaceae)、卫矛科(celastraceae)、冬青科(aquifoliaceae)、黄杨科(buxaceae)、大戟科(euphorbiaceae)、小盘木科(pandaceae)、鼠李科(rhamnaceae)、葡萄科(vitaceae)、漆树科(anacardiaceae)，橄榄科(burseraceae)、桔梗科(campanulaceae)、红树科(rhizophoraceae)、檀香科(santalaceae)、木犀科(oleaceae)、玄参科(scrophulariaceae)、禾本科(gramineae)、露兜树科(pandanaceae)、黑三棱科(sparganiaceae)、水蕹科(aponogetonaceae)、眼子菜科(potamogetonaceae)、茨藻科(najadaceae、冰沼草科(scheuchzeriaceae)、泽泻科(alismataceae)、花蔺科(butomaceae)、水鳖科(hydrocharitaceae)、霉草科(triuridaceae)、莎草科(cyperaceae)、棕榈科(槟榔科)(palmae(arecaceae))、天南星科(araceae)、浮萍科(lemnaceae)、须叶藤科(flagellariaceae)、帚灯草科(restionaceae)、刺鳞草科(centrolepidaceae)、黄眼草科(xyridaceae)、谷精草科(eriocaulaceae)、凤梨科(bromeliaceae)、鸭跖草科(commelinaceae)、雨久花科(pontederiaceae)、田葱科(philydraceae)、灯心草科(juncaceae)、百部科(stemonaceae)、百合科(liliaceae)、石蒜科(amaryllidaceae)、蒟蒻薯科(箭根薯科)(taccaceae)、薯蓣科(dioscoreaceae)、鸢尾科(iridaceae)、芭蕉科(musaceae)、姜科(zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(marantaceae)、水玉簪科(burmanniaceae)、藜科(chenopodiaceae)、兰科(orchidaceae)、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物包括禾本科植物，较佳地，禾本科农作物。
在另一优选例中，所述的禾本科植物选自下组：小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、狗尾草、烟草、拟南芥、或其组合。
在另一优选例中，所述的水稻包括籼稻、粳稻、或其组合。
本发明第二方面提供了一种exp10基因或其蛋白的抑制剂的用途，用于制备抗虫的组合物或制剂。
在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。
在另一优选例中，所述抗虫包括杀灭害虫、抑制生长、昆虫拒食等。
在另一优选例中，所述害虫包括昆虫，尤其是飞虱科的昆虫。
在另一优选例中，所述飞虱科的昆虫选自下组：褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱、或其组合。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述反义核酸包括sirna、shrna、和/或mirna。
在另一优选例中，所述的exp10基因包括cdna序列、基因组序列、或其组合。
在另一优选例中，所述exp10基因来自禾本科作物。
在另一优选例中，所述的exp10基因来自选自下组的一种或多种植物：水稻、小麦、玉米、高粱、或其组合。
在另一优选例中，所述exp10基因选自下组：水稻的exp10基因(xm_015781332.1)、小麦的exp10基因(ay543533.1)、玉米的exp13基因(nm_001138432)、高粱的exp10基因(xm_002446945.1)、或其组合。
在另一优选例中，所述exp10蛋白的氨基酸序列选自下组：
(i)具有seqidno.:1所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如seqidno.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述抗虫功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与seqidno.:1所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述抗虫功能的多肽。
在另一优选例中，所述exp10基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如seqidno.:1所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.:2所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；
(d)在seqidno.:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于调控植物的选自下组的一种或多种农艺性状：
(i)株高；
(ii)籽粒；
(iii)颖壳细胞的长度。
在另一优选例中，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i)降低株高；和/或
(ii)降低籽粒大小；和/或
(iii)缩短颖壳细胞的长度。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：杨柳科(salicaceae)、桑科(moraceae)、桃金娘科(myrtaceae)、石松科(lycopodiaceae)、(selaginellaceae)、银杏科(ginkgoaceae)、松科(pinaceae)、苏铁科(cycadaceae)、天南星科(araceae)、毛茛科(ranunculaceae)、悬铃木科(platanaceae)、榆科(ulmaceae)、胡桃科(juglandaceae)、桦科(betulaceae)、猕猴桃科(actinidiaceae)、锦葵科(malvaceae)、梧桐科(sterculiaceae)、椴树科(tiliaceae)、柽柳科(tamaricaceae)、蔷薇科(rosaceae)、景天科(crassulaceae)、苏木科(caesalpinaceae)、蝶形花科(fabaceae)、石榴科(punicaceae)、珙桐科(nyssaceae)、山茱萸科(cornaceae)、八角枫科(alangiaceae)、卫矛科(celastraceae)、冬青科(aquifoliaceae)、黄杨科(buxaceae)、大戟科(euphorbiaceae)、小盘木科(pandaceae)、鼠李科(rhamnaceae)、葡萄科(vitaceae)、漆树科(anacardiaceae)，橄榄科(burseraceae)、桔梗科(campanulaceae)、红树科(rhizophoraceae)、檀香科(santalaceae)、木犀科(oleaceae)、玄参科(scrophulariaceae)、禾本科(gramineae)、露兜树科(pandanaceae)、黑三棱科(sparganiaceae)、水蕹科(aponogetonaceae)、眼子菜科(potamogetonaceae)、茨藻科(najadaceae、冰沼草科(scheuchzeriaceae)、泽泻科(alismataceae)、花蔺科(butomaceae)、水鳖科(hydrocharitaceae)、霉草科(triuridaceae)、莎草科(cyperaceae)、棕榈科(槟榔科)(palmae(arecaceae))、天南星科(araceae)、浮萍科(lemnaceae)、须叶藤科(flagellariaceae)、帚灯草科(restionaceae)、刺鳞草科(centrolepidaceae)、黄眼草科(xyridaceae)、谷精草科(eriocaulaceae)、凤梨科(bromeliaceae)、鸭跖草科(commelinaceae)、雨久花科(pontederiaceae)、田葱科(philydraceae)、灯心草科(juncaceae)、百部科(stemonaceae)、百合科(liliaceae)、石蒜科(amaryllidaceae)、蒟蒻薯科(箭根薯科)(taccaceae)、薯蓣科(dioscoreaceae)、鸢尾科(iridaceae)、芭蕉科(musaceae)、姜科(zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(marantaceae)、水玉簪科(burmanniaceae)、藜科(chenopodiaceae)、兰科(orchidaceae)、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物包括禾本科植物，较佳地，禾本科农作物。
在另一优选例中，所述的禾本科植物选自下组：小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、狗尾草、烟草、拟南芥、或其组合。
在另一优选例中，所述的水稻包括籼稻、粳稻、或其组合。
本发明第三方面提供了一种exp10基因或其蛋白的抑制剂的用途，用于制备抗植物稻瘟病的组合物或制剂。
在另一优选例中，所述exp10蛋白的氨基酸序列选自下组：
(i)具有seqidno.:1所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如seqidno.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述抗植物稻瘟病功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与seqidno.:1所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述抗植物稻瘟病功能的多肽。
在另一优选例中，所述exp10基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如seqidno.:1所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.:2所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；
(d)在seqidno.:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明第四方面提供了一种exp10基因或其蛋白的促进剂的用途，用于调控植物的农艺性状或制备调控植物农艺性状的制剂或组合物，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：
(i)株高；
(ii)籽粒；
(iii)颖壳细胞的长度。
在另一优选例中，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i)增加株高；和/或
(ii)增加籽粒的大小；和/或
(iii)增加颖壳细胞的长度。
本发明第五方面提供了一种改良植物农艺性状的方法，包括步骤：
提高或降低所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性，从而改良植物的农艺性状。
在另一优选例中，当提高所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性时，所述“改良植物的农艺性状”包括：
(i)增加株高；和/或
(ii)增加籽粒的大小；和/或
(iii)增加颖壳细胞的长度。
在另一优选例中，当降低所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性时，所述“改良植物的农艺性状”包括：
(i)降低株高；和/或
(ii)降低籽粒大小；和/或
(iii)缩短颖壳细胞的长度；和/或
(iv)抗虫；和/或
(v)抗稻瘟病。
在另一优选例中，所述抗虫包括杀灭害虫、抑制生长、昆虫拒食等。
在另一优选例中，所述害虫包括昆虫，尤其是飞虱科的昆虫。
在另一优选例中，所述飞虱科的昆虫选自下组：褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱、或其组合。
在另一优选例中，所述方法包括给予植物exp10基因或其编码的蛋白的促进剂或抑制剂。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(i)提供一植物或植物细胞；和
(ii)将exp10基因或其编码的蛋白肽的促进剂或抑制剂导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因的植物或植物细胞。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述反义核酸包括sirna、shrna、和/或mirna。
在另一优选例中，所述促进剂指促进exp10基因或其蛋白表达的物质。
本发明第六方面提供了一种提高植物抗虫或抗稻瘟病的方法，包括步骤：
降低所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性，从而提高植物的抗虫活性或抗稻瘟病的活性。
在另一优选例中，所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性降低了50％-100％，较佳地，60％-95％，更佳地，70-90％，从而提高植物的抗虫活性或抗稻瘟病的活性。
本发明第七方面提供了一种转基因植株，所述转基因植株中导入exp10基因或其编码的蛋白的促进剂或抑制剂。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述反义核酸包括sirna、shrna、mirna。
在另一优选例中，所述促进剂指促进exp10基因或其蛋白表达的物质。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了osexp10基因的表达谱分析。其中，a：不同生长发育时期的不同组织中osexp10基因的表达检测；b：osexp10超表达和rnai转基因植株中osexp10基因的表达检测；c：褐飞虱取食后不同时间段osexp10基因的表达检测。
图2显示了osexp10基因的超表达和rnai转基因植株对株高的影响。其中，a：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的整体外观(抽穗前)；b：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的整体外观(抽穗后)；c：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的株高统计(2016年大田)；d：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的分蘖数统计(2015年大田)。
图3显示了osexp10基因的超表达和rnai转基因植株对粒形的影响。其中，a：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的粒长；b：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的粒宽；c：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的粒长统计；d：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的粒宽统计；e：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的千粒重统计。
图4显示了osexp10基因的crisper阳性株对粒形的影响。
图5显示了osexp10基因的超表达和rnai转基因植株对颖壳表面细胞的影响。其中，a：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的颖壳表面扫描电镜；b：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的颖壳表面单个细胞的面积统计；c：osexp10基因的超表达和rnai转基因植株的颖壳表面总面积的统计。
图6显示了osexp10基因超表达和rnai转基因植株对褐飞虱和稻瘟病的抗性鉴定。其中，a：osexp10基因超表达转基因植株对褐飞虱的抗性鉴定结果；b：osexp10基因rnai转基因植株对褐飞虱抗性鉴定的结果；c：osexp10基因超表达和rnai转基因植株对稻瘟病的抗性鉴定的结果。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物农艺性状位点的研究和筛选，首次意外地发现了一种exp10基因或其蛋白，通过对该基因的表达模式进行分析，首次发现，提高或降低所述植物(如水稻)中exp10基因或其蛋白的表达量或活性，可显著改良植物的农艺性状。在此基础上，发明人完成了本发明。
具体地，当提高所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性时，可(i)增加株高；和/或(ii)增加籽粒的大小；和/或(iii)增加颖壳细胞的长度。当降低所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性时，可(i)降低株高；和/或(ii)降低籽粒大小；和/或(iii)缩短颖壳细胞的长度；和/或(iv)抗虫；和/或(v)抗稻瘟病。
exp10基因
如本文所用，术语“本发明的exp10基因”、“exp10基因”可互换使用，均指来源于农作物(如水稻、小麦)的exp10基因或其变体。在一优选实施方式中，本发明的exp10基因的核苷酸序列如seqidno.:2所示。
本发明还包括与本发明的优选基因序列(seqidno.:2)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调控农作物(如水稻)的农艺性状。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
在本发明中，seqidno.:2中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成seqidno.:2的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与seqidno.:2的同源性较低，也能基本编码出如seqidno.:1所示的氨基酸序列。另外，“在seqidno.:2中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与seqidno.:2所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如seqidno.:2所示)具有一定同源性(保守性)的exp10的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。
本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括：dna、基因组dna或人工合成的dna，dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seqidno.:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
应理解，虽然本发明的exp10基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻exp10基因高度同源(如具有80％以上，如85％,90％,95％甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。
本发明的exp10核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的dna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
exp10基因编码的多肽
如本文所用，术语“本发明多肽”、“exp10基因的编码蛋白”、可以互换使用，都是指来源于水稻的exp10的多肽及其变体。在一优选实施方式中，本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如seqidno.:1所示。
本发明涉及一种调控农艺性状的exp10多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如seqidno.:1所示。本发明的多肽能够有效调控农作物(如水稻)的农艺性状。
本发明还包括与本发明的seqidno.:1所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指：“调控植物或农作物(如水稻)的农艺性状”。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有exp10蛋白活性的exp10蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然exp10蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明中，所述的多肽变体是如seqidno.:1所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在c末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。
表1
本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然seqidno.:1差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
在本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用cacl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如水稻细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的sv40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
稻瘟病
稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。世界各稻区均匀发生。本病在各地均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。近年来，广东稻瘟病年发生面积不少于50万亩，而且出现逐年增加趋势，局部大爆发并不少见，目前，稻瘟病可能发生在省域内的任何年头、任何季节。
在本发明中，通过降低所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性，从而提高植物的抗稻瘟病活性。
其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。
通过所述的提高植物抗稻瘟病能力的方法获得的转基因植物及其杂交后代也包括在本发明内。
提高植物抗虫能力的方法
在本发明中，还提供了一种提高植物抗虫的方法，包括：
降低所述植物中exp10基因或其蛋白的表达量或活性，从而提高植物的抗虫活性。
其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。
通过所述的提高植物抗虫能力的方法获得的转基因植物及其杂交后代也包括在本发明内。
本发明针对有害昆虫如飞虱科的昆虫(优选，褐飞虱)的防治难题，意外的发现通过在植物(如水稻)中敲除exp10基因，可实现对昆虫的广谱抗生，在植物中敲除该基因，可有效抵御有害昆虫的危害，所述方法方便、快捷、准确且无公害。
调控植物的农艺性状
在本发明中，还提供了一种调控植物农艺性状的方法，具体地，调控exp10基因或其编码蛋白的表达，从而调控植物的农艺性状，所述农艺性状选自下组的一种或多种：
(i)株高；
(ii)籽粒；
(iii)颖壳细胞的长度；
(iv)飞虱科昆虫的抗性；
(v)稻瘟病抗性。
在一优选实施方式中，所述调控指促进或抑制exp10基因或其编码蛋白的表达。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次筛选到一种exp10基因，该基因编码一种细胞膨胀素，可参与到水稻对飞虱科昆虫(尤其是褐飞虱)的抗性过程。
(2)本发明首次发现，降低exp10基因或其蛋白的表达，可调控植物的农艺性状，比如，降低株高、降低籽粒大小、缩短颖壳细胞的长度、抗虫、抗稻瘟病等。
(3)本发明首次发现，提高exp10基因或其蛋白的表达，可调控植物的农艺性状，比如，增加株高、增加籽粒的大小、增加颖壳细胞的长度等。
(4)本发明首次发现，exp10基因在植物(如水稻)生长期为一个月之内的不同组织中的表达量比较高，而在3个月左右的苗的不同组织中的表达量偏低
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
材料：水稻材料zh11，exp10oe和exp10rnai，以及exp10-cas9种植于中国科学院上海生命科学研究院的人工气候室。褐飞虱采集自上海田间并在中国科学院上海生命科学研究院的实验室以水稻品种zh11进行饲养。
载体构建：全长osexpa10基因通过pcr方法扩增自水稻cdna，并通过xbai和smai酶切连接到p1301-35snos载体(购自cambia公司)上进行超表达。而exp10rnai载体则是通过将基因的329bp的一段通过正向和反向连接到载体ds1301(购自cambia公司)上。ngg之前20bp的一段序列分别连接到载体和载体上。所有的载体通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻品种zh11.
褐飞虱抗性鉴定以及病原菌接种实验：一月大小的水稻苗接种12只二龄期的褐飞虱，5-7天后观察水稻苗的存活状况并拍照。2周大的水稻苗通过喷洒接种稻瘟病菌ch14(zb1)，约5天后观察叶片病斑大小检测抗病性。
rna提取和qrt-pcr分析：总rna通过trizol(lifetechnologies)进行抽提并用toyobo的反转录试剂盒进行反转录，real-timepcr用toyobo的相应试剂盒进行并取3个生物学重复。
扫描电镜(sem)观察：新鲜的叶鞘和颖壳用70％的faa过夜固定。通过酒精梯度脱水、临界点干燥、喷金等一系列过程制备样品，然后通过hitachis-2460进行观测并拍照。
实施例1osexp10基因的表达谱
经过大量筛选实验室之前保存的t-dna插入的突变体库，筛选得到一株具有明显感虫表型的突变体。经过旁临序列分析，得到该突变体的旁临序列，经旁临基因的表达分析，发现突变体中osexp10基因得到明显超表达，osexp10基因的序列号为loc_os04g49410(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。本研究中，首先对该基因的表达模式进行了分析，发现该基因在生长期为一个月之内的不同组织中的表达量比较高，而在3个月左右的苗的不同组织中的表达量偏低(图1a)。
在本实验室对褐飞虱研究的过程中，注意到osexp10基因可能参与到水稻对褐飞虱的抗性过程中，对osexp10基因的表达受褐飞虱诱导情况进行了检测，发现褐飞虱的取食能够显著抑制osexp10基因的表达(图1c)，说明osexp10基因介入到褐飞虱和水稻的相互作用过程中。
为进一步研究osexp10基因的功能，克隆了osexp10基因并分别构建到超表达载体p1301-35snos(获自中国科学院上海生命科学研究院)中和rnai载体ds1301(获自中国科学院上海生命科学研究院)中，以及构建了crisper载体(本体系由pos-sgrna载体和ph-ubi-cas9载体构成，获自中科院遗传发育研究所)。并通过农杆菌介导的遗传转化方法，将这三个质粒转化到野生型水稻zh11(获自中国科学院上海生命科学研究院)中。
实施例2osexp10基因超表达和rnai转基因的植株表型说明其具有调控水稻生长发育的功能
克隆了水稻osexp10基因，并且将该基因的编码区构建到超表达质粒p1301-35snos中，形成osexp10oe质粒，然后将该质粒通过农杆菌介导的遗传方法转化到野生型水稻zh11背景中。对超表达转基因植株中的osexp10基因的表达进行了检测，检测结果(图1b)显示，超表达转基因植株中osexp10基因得到了非常明显的上调表达。
转基因植株呈现出明显的表型，主要体现在：①转基因植株的株高变高(图2，a、b、c)，但是对水稻的分蘖数没有明显影响(图2d)；②转基因植株的籽粒变大(图3)。③颖壳的扫描电镜分析显示细胞有加长的表型(图5)。
同时，选取了osexp10基因cdna中一段329bp的区段为模板，连接到p1301rnai载体上(购自cambia公司)，构建了rnai质粒(exp10rnai，获自中国科学院上海生命科学研究院)。并通过农杆菌介导的遗传转化方法，将质粒转化到野生型水稻zh11背景中。对rnai转基因植株中的osexp10基因的表达进行了检测，检测结果(图1b)显示，rnai转基因植株中，osexp10基因得到了明显的下调。转基因植株呈现出的表型主要有：①转基因植株的株高变矮(图2，a、b、c)，但是对水稻的分蘖数没有明显影响(图2d)；②转基因植株的籽粒变小(图3)。③颖壳的扫描电镜分析显示细胞有缩短的表型(图5a－5c)
此外，根据osexp10基因的序列，设计并构建了crisper质粒cas9-exp10，(空质粒获自中科院上海生科院逆境生物学研究中心)，并通过农杆菌介导的遗传转化方法转到野生型水稻zh11的背景中。t0代中呈现出双链被同时敲除的crisper阳性植株，这些阳性植株的表型主要表现为粒形变小(图4)。t0代转基因植株种植在人工气候室中，尚不能很好地判定是否会株高有影响，需要将下一代种植到大田当中进行统计。
实施例3osexp10基因超表达和rnai转基因植株的表型说明其具有调控褐飞虱抗性的功能
为检测osexp10基因是否介导了对褐飞虱的抗性。分别将生长50天左右的osexp10基因的超表达和rnai转基因的苗进行了对褐飞虱抗性的鉴定。结果显示，同野生型zh11相比较，osexp10基因超表达的转基因植株呈现出明显的易感褐飞虱的表型(图6a)，而osexp10基因rnai的转基因植株，则呈现出明显的抗褐飞虱的表型(图6b)。
实施例4osexp10基因超表达和rnai转基因植株的表型说明其具有调控稻瘟病抗性的功能
为检测osexp10基因是否具有介导水稻抗病的功能，分别将osexp10基因超表达的转基因植株和rnai的转基因植株接种了稻瘟病菌。
结果显示，osexp10基因超表达的转基因植株呈现出明显增大的病斑，而osexp10基因rnai转基因植株呈现出明显减少的病斑(图6c)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>osexp10基因调控水稻生长以及对褐飞虱抗性的应用
<130>p2017-0450
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>257
<212>prt
<213>水稻（oryzasativa）
<400>1
metalaprocysleuleuleuvalleupheleuleuproalaleuala
151015
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202530
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<210>2
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<213>水稻（oryzasativa）
<400>2
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