本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种从哺乳动物癌组织制备的类癌组织、方法及用途。
背景技术
结直肠癌是世界范围内三大常见恶性肿瘤之一，随着生活方式的改变，其发病呈上升趋势，直肠癌约占结直肠癌的三分之一。局部进展期直肠癌是指经影像学或病理检查发现的原发肿瘤侵润出肠壁肌层直至周围有名结构(c/pt3-4b)或系膜内及真骨盆范围内出现淋巴结转移(c/pn1-2)而无远处转移(m0)的距肛门12cm以内的直肠癌(中国局部进展期直肠癌诊疗专家共识，2017)。局部进展期直肠癌的处理是大肠癌领域治疗的重点和难点之一，不同治疗方法在局部进展期直肠癌中的应用使得不同方法组合而成的治疗策略也越来越多。传统的对局部进展期直肠癌的治疗以外科手术结合手术后的放化疗为主。但在过去的10余年中，随着多项大型iii期临床研究结果的公布，对于局部进展期直肠癌，术前的新辅助放化疗联合根治性手术已成为了标准治疗模式。相对于术后放化疗，术前放化疗有其临床和生物学上的优点。主要包括：放疗后肿瘤降期退缩，可提高切除率；对低位直肠肿瘤，肿瘤的退缩可能增加保留肛门括约肌的机会；降低术中播散的概率；肿瘤乏氧细胞少，对放疗较术后放疗敏感；小肠的蠕动度较术后大，未坠入盆腔，治疗的不良反应较低。
虽然进展期直肠癌术前新辅助放化疗总体上能够让患者获益，然而仍有相当比例患者新辅助治疗效果差，不能带来肿瘤降期退缩等获益。因此如选择出真正适合放化疗的患者有利于指导其个体化治疗，避免过度治疗非常重要，且符合精准医疗精神。另外部分患者新辅助放化疗后可获得肿瘤的完全消退，有研究证明这部分患者采取新辅助治疗后观察等待的策略，其远期生存与新辅助后再行手术治疗并无差别。因此如果放化疗后获得肿瘤完全消退，或许可以减弱后续的治疗，但这必须建立在准确的疗效评价基础上。新辅助治疗后评价方式主要包括肝门指诊、影像学及肠镜检查等，预测的准确率在30-60％之间，预测准确率较低。综上所述，寻找一种准确的检测方式，在新辅助放化疗前识别出对放化疗耐受的患者避免过度治疗，以及识别出对新辅助放化疗很敏感有可能获得完全病理缓解的患者采取观察等待策略避免手术，是目前进展期直肠癌领域的研究热点。
现有技术中直肠癌的新辅助放化疗的评估包括下述8种。
1、肿瘤细胞系，肿瘤细胞系比较容易培养，能够用于开展大规模抗肿瘤药物(或疗法)筛选。但肿瘤细胞系有若干天然的重大缺陷：1)某个肿瘤细胞系建系来源于某个患者肿瘤组织，众所周知，不同肿瘤患者的肿瘤具有很大的异质性，因此某个或某几个肿瘤细胞系不能代表临床上的每位患者；2)肿瘤细胞系的遗传背景和基因表达谱与临床患者肿瘤组织中的肿瘤细胞相差较大；3)肿瘤细胞系往往经过非常多次的传代，其遗传背景和基因表达情况会有变化，且存在交叉污染的风险。因此截至目前，肿瘤细胞系只能作为临床转化前的基础探索性研究工具，不具备直接临床转化能力。肿瘤细胞系无法用于预测直肠癌新辅助患者的放化疗疗效。
2、人源性肿瘤组织异种移植(pdtx,patient-derivedtumorxenografts)，人源性肿瘤组织异种移植是将患者肿瘤组织分离处理后接种于异种小鼠体内生长的肿瘤研究工具。pdtx保持了肿瘤细胞的分化程度、形态特征、结构特点以及分子特性，在某种程度上，移植后小鼠肿瘤的血运特点、基质特征、坏死状况等与人本身的肿瘤特点一致。相比肿瘤细胞系，pdtx能够代表所来源的肿瘤组织，其对药物或其他疗法的反应也能够较为真实地代表临床上患者的反应。因此pdtx可以用于预测药物或其他疗法的临床治疗效果。pdtx在临床转化研究方面同样存在很多问题。首先，pdtx模型的建立和应用需时较长，从获取肿瘤组织、接种、传代、开始实验至获得数据往往需要数月时间，而临床患者从诊断明确到治疗开始常常只需数周时间。其次，pdtx模型需要花费大量人力物力资源才能得以完成。另外，pdtx缺乏统一明确的模型建立、疗效评估标准，其实验结果的可靠性有待进一步提高。再次，实验动物对药物或其他疗法的耐受性与人体差别较大，可能使得人体能良好耐受而实验动物耐受较差的疗法无法得到评估。最后，pdtx将人体组织接种到实验动物身上，存在一定的伦理问题。以上缺点都极大地限制pdtx在转化医学领域中的应用。综合考虑时间、成本、可靠性和伦理方面的因素，无法使用pdtx模型来预测直肠癌患者新辅助放化疗疗效。
3、直肠指诊，直肠指诊是直肠癌诊断、疗效评估最常用的手段。几乎所有直肠癌患者在诊断时都将进行直肠指诊检查，并且在治疗过程中和治疗后，临床医生也都将使用直肠指诊大概判断肿瘤退缩程度以评估治疗效果。直肠指诊只能大概评估肿瘤突出于肠腔的那部分大小和肿瘤的大概浸润程度，严重依赖临床医生经验，而且无法准确量化，在临床疗效评估上只能作为参考。同时直肠指诊只能获得肿瘤的大小、硬度等物理性状，无法用于预测肿瘤对药物或其他疗法的真实反应。
4、超声内镜，超声内镜也被广泛用于直肠癌的诊断和疗效评估。超声内镜能够较为准确地判断出肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移情况等信息。超声内镜仅仅能获得肿瘤的形态学特征，因此其：1)不能用于在治疗前预测肿瘤对药物或其他疗法的反应；2)治疗后的超声形态学评估不能准确预测肿瘤对药物或其他疗法的真实反应。
5、ct，ct与超声内镜类似，能够获得肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移等信息，被用于直肠癌的诊断与治疗效果评估。与超声内镜相类似，ct仅仅能获得肿瘤的形态学特征，因此其：1)不能用于在治疗前预测肿瘤对药物或其他疗法的反应；2)治疗后的超声形态学评估不能准确预测肿瘤对药物或其他疗法的真实反应。
6、核磁共振成像(magneticresonanceimaging)，mri技术相比超声内镜和ct，是直肠癌中最常用的诊断和疗效评估工具，其能更准确地获得肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移等信息。尤其随着mri技术的进步，目前已普遍将其应用于直肠癌新辅助放化疗的疗效评价，并且越来越多的研究采用mri相关参数来预测放化疗疗效。其中弥散加权成像(diffusionweightedimaging,dwi)是一种能在活体反应水分子扩散能力及运动方向的mri功能成像技术，不仅可用于直肠癌的诊断，其表观扩散系数(apparentdiffusioncoefficient,adc)在治疗过程中的动态变化也可用于放化疗的疗效预测，有研究表明dwi联合常规mri可提高评估的准确性，达52-64％。另外基于mri高分辨率序列t2wi影像的肿瘤退缩分级(mrtumorregressiongrade,mrtrg)可对患者的远期生存做出预测，并且与手术后的病理肿瘤退缩分级(ptrg)符合率较高。首先，mri获得的直肠癌肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移情况、直肠系膜筋膜和脉管侵犯情况等信息只能在开始治疗后用于评估疗效，不能用于在治疗前预测直肠癌对药物或其他疗法的反应；其次mri对开始治疗后的疗效评估准确性最高60％左右，仍较低，并不能有效区别病理完全缓解(pcr)及显微镜下微病灶残留。
7、pet-ct，pet-ct也是肿瘤诊断及监测的重要工具。有研究表明直肠癌在放疗后两周出现肿瘤体积缩小，可表现为糖代谢摄取的降低，并且能预测放化疗疗效。vanstiphout等用肿瘤长度、放化疗前后肿瘤细胞对18f-fdg最大摄取值及其变化几项指标建立了一个预测局部进展期直肠癌放化疗后pcr的模型，取得了较好的准确度(auc＝0.86)。首先pet-ct获取的肿瘤小大、代谢强度等信息无法在治疗前预测肿瘤对药物或其他疗法的反应。其次放射诱导的炎性反应，炎性肠病和偶然的肠道穿孔等可能导致葡萄糖摄取信号的变化，导致pet-ct的疗效评估产生误差。另外pet-ct检查价格较为昂贵(8000rmb左右)，限制其使用。最后pet-ct评估直肠癌治疗疗效的准确度虽较高，但仍需很大程度提高。
8、病理学评价，病理学评价包括治疗前的肿瘤诊断和新辅助放化疗后术后的病理学检查。术后病理学评估对放化疗治疗反应进行分级计分，即trg评分，分别为0分(完全反应，即未发现活的肿瘤细胞)，1分(中度反应，即单个或小簇癌细胞残留)、2分(轻度反应，即残留癌灶，间质纤维化)，3分(反应不良，即少数或无肿瘤细胞消退，大量癌残留)。术后病理学评估是评价直肠癌新辅助放化疗疗效的金标准。治疗前的病理学评估是为了明确诊断，不能提供肿瘤对放化疗治疗的反应信息，不能用于疗效预测。术后病理学评估虽是评价新辅助放化疗疗效的金标准，但必须在手术后进行，无法对手术前的治疗决策提供任何帮助。
基于现有技术中直肠癌的诊断和疗效评估的8种方法存在的弊端，近年来又提出了类器官/组织的方法。
类器官/组织是将具有干性潜能的细胞进行3d培养，从而形成相应器官/组织的类似器官/组织。类器官/组织能最大程度地模拟体内组织结构及功能并能长期传代培养。目前已有研究者开始研究建立肺、胃、小肠、大肠、肝脏、胰腺、前列腺等类器官/组织模型。另外多项研究结果表明正常肠道类器官药物的反应可以用来预测患者的临床疗效。例如，一项关于肠道囊性纤维化的研究表明(dekkersjf,berkersg,kruisselbrinke,etal.characterizingresponsestocftr-modulatingdrugsusingrectalorganoidsderivedfromsubjectswithcysticfibrosis.scitranslmed.2016,8(344):344ra84.)，其类器官的药物反应情况与已发表的临床试验数据结果一致，并且对于三例少见突变患者，两例类器官药物反应很好的患者用药后取得了比较好的结果，一例类器官反应不好的患者临床效果也不好。然而，在现有技术中，肿瘤细胞的体外培养，对于形成完整的类组织和相应的药物筛选、数据检测的准确性影响上仍有一定的障碍，基础培养基不能完整的模拟肿瘤细胞体内环境是主要原因，如中国专利cn106190980a公开了一种基于食管癌组织用于体外培养肿瘤类组织的培养基，其使用的仍然是普通体外培养基和人工加入的部分细胞因子，培养效果一般，中国专利cn105358677a公开了从分离的上皮干细胞形成上皮类器官的方法，但其针对的细胞来源和培养方法和本申请并不相同。
现有技术针对直肠癌的类组织的研究，如(satot,stangede,ferrantem,etal.long-termexpansionofepithelialorganoidsfromhumancolon,adenoma,adenocarcinoma,andbarrett'sepithelium.gastroenterology.2011,141(5):1762-72)，均存在以下几个问题：1)活检标本组织的提取过程容易导致提取失败，消化不完全；2)直肠活检虽有肠道准备，但活检标本均有不同程度粪便污染，培养容易污染；3)培养基不合适等因素导致培养成功率低；4)采用现有技术培养的直肠癌的类组织评估直肠癌术前新辅助放化疗的准确性不高。
综上所述，现有技术还缺少可用于评估新辅助放化疗疗效的类癌组织及其功能，以及能够高效培养类癌组织的培养基、消化液、方法。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明提供了一种可用于评估新辅助放化疗疗效的类癌组织及其功能，以及能够高效培养类癌组织的培养基、消化液、方法。
一种从哺乳动物癌组织制备的类癌组织的方法，包括以下步骤：
a1)将从哺乳动物分离的癌组织置于消化液中进行消化，分离为细胞；
a2)将细胞置于用bsa润洗的离心管中，离心，去上清；
a3)向离心管加入专用培养基，重悬细胞；
a4)将细胞悬液与解冻的基质胶混合，接种于培养板，待基质胶凝固，加入专用培养基培养。
优选地，bsa的浓度为0.1％。
优选地，专用消化液包括：dmem培养基,胎牛血清，胶原酶iv和胶原酶ii。
优选地，胎牛血清的浓度为0.2％-20％；进一步优选地，胎牛血清的浓度为0.5％-1％。
优选地，胶原酶iv的浓度为200-700u/ml；进一步优选地，胶原酶iv的浓度为500-600u/ml。
优选地，胶原酶ii的浓度为1-5mg/ml；进一步优选地，胶原酶ii的浓度为1.5-3.5mg/ml。
优选地，消化时间为30-50min；进一步优选地，消化时间为40-45min。
优选地，所述专用培养基包括：dmem/f12培养基、r-spondin1蛋白、表皮细胞生长因子、前列腺素e-2；进一步优选地，所述专用培养基包括：dmem/f12、r-spondin1、noggin、egf、hepes、glutamax、normocin、gentamicin/amphoteritin、n2、b27、n-acetylcysteine、sb202190、gastrin、prostaglandine2。
优选地，本发明所述的方法，还包括以下步骤：
b1)将哺乳动物分离的癌组织置于含抗生素的pbs内洗涤；首先经过5min×5次的含抗生素pbs震洗后再切碎消化，且应尽量切碎有利于消化和后续分离；对于极小且松散标本，应减少震洗次数或考虑不震洗，避免标本丢失殆尽。
优选地，所述哺乳动物包括人，进一步优选地，人癌组织包括结肠癌组织、直肠癌组织。
本发明还包括一种类癌组织，采用本发明提供的从哺乳动物癌组织制备的类癌组织的方法进行培养。
优选地，所述类癌组织为直肠癌类癌组织。进一步优选地，所述的直肠癌类癌组织形态包括：空腔型、致密实体型、分化型。
本发明还包括采用本发明的类癌组织在评估直肠癌新辅助放化疗的疗效中的用途。
本发明还包括类癌组织评估直肠癌新辅助放化疗的疗效的方法，该方法包括：评估类癌组织对放疗和化疗药物的敏感性。
优选地，所述化疗药物包括5-fu、cpt-11。
优选地，所述类癌组织对放疗的敏感性采用类癌组织存活数评估。
优选地，放疗敏感性观察时间至少为放疗后9天。
优选地，本发明的直肠癌类癌组织还可以用于以下3种情况的预测：1)局部复发后需行放化疗；2)术后辅助放化疗；3)转移性直肠癌患者需行放化疗。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
1、本发明提出了可用于评估新辅助放化疗疗效的类癌组织及其功能，以及能够高效培养类癌组织的培养基、消化液、方法；本发明通过改进培养方法及培养基、消化液，使类癌组织培养成功率达80％以上。
2、本发明提出，类癌组织的放疗和药物敏感性能预测患者术前新辅助放化疗疗效，诊断效率达80％以上；根据患者类癌组织对放疗和药物的敏感性，可以指导进展期直肠癌患者选择是否进行新辅助放化疗治疗；根据患者类癌组织对放疗和药物的敏感性，可以指导进展期直肠癌患者新辅助放化疗治疗后选择继续手术治疗或采取等待观察策略。
3、本发明提供了新的、准确性更高的的类癌组织的放疗敏感性评估方法；利用cck8等检测细胞活性的手段评估类组织放疗和药物敏感性，其不能有效区分敏感与耐受的类组织，临床预测能力也较差；肉眼光镜下(或拍照)观察判断类组织是否存活，或勾画计算类组织面积变化情况，能有效区分放疗和药物敏感、耐受类组织，并能准确预测直肠癌临床患者新辅助放化疗疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例的3个病人的直肠癌活检标本；
图2是本发明实施例的3个直肠癌类癌组织；
图3是本发明实施例的3种类型的直肠癌类癌组织；
图4是本发明实施例的直肠癌类癌组织；
图5是本发明实施例的x线照射剂量与cck8的关系图；
图6是本发明实施例的x线照射剂量与类癌组织存活数的关系图；
图7是本发明实施例的本发明类癌组织死亡与存活图；
图8是本发明实施例的不同类癌组织在不同x线照射剂量下的存活情况；
图9是本发明实施例的不同类癌组织在不同x线照射剂量下的存活曲线；
图10是本发明实施例的放疗耐受和放疗敏感两种类型的类癌组织接受8gy照射后的恢复情况；
图11是本发明实施例的8gy照射后的面积变化曲线；
图12是本发明实施例的5-fu耐受和5-fu敏感两种类型的类癌组织面积随时间变化情况；
图13是本发明实施例的5-fu处理后类癌组织面积的变化曲线；
图14是本发明实施例的cpt-11耐受和cpt-11敏感两种类型的类癌组织面积随时间变化情况；
图15是本发明实施例的cpt-11处理后类癌组织面积的变化曲线；
图16是本发明实施例的实验室实验和临床试验框架图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
实施例1
采用以下方法制备本发明所述的类癌组织。
1)直肠癌新辅助放化疗患者活检标本类癌组织提取：取3个病人的直肠癌活检标本，如图1所示，然后放入离心管，冰盒带回实验室。预冷pbs洗5minx5次。冰盆表面放置无菌培养皿，倒入预冷灭菌pbs，将直肠癌组织置于其中，无菌刀片切成碎片后移入37℃预热消化液中，37℃水浴摇床消化。消化完毕后用移液枪适度吹打，冰上放置几分钟肿瘤碎片沉淀后取上清后加入预冷pbs继续吹打，直至肿瘤碎片消失为止。随后离心5min沉淀所有直肠癌隐窝；接着预冷pbs洗五次，每次5min；然后200g离心沉淀所有隐窝。弃上清后准备接种隐窝3d培养。
2)直肠癌类癌组织培养流程：直肠癌隐窝提取后用枪头加入适量基质胶，随后用200ul枪头悬浮混匀，接种于预热培养板中，每孔50ul。接种后培养板置于37℃恒温培养箱中孵育5min拿出，每孔加入500ul培养基后镜下观察接种情况，随后置于培养箱中培养。每日观察类癌组织生长情况并拍照；每3日更换培养基。
3)直肠癌类癌组织传代：将培养孔内培养基吸去，枪头将基质胶吹散，移入15ml无菌离心管中吹打将基质胶完全吹散混匀，在4℃下离心5min，将上清及沉淀在底部的基质胶吸去；加入预冷pbs重新悬浮管底类癌组织。按类癌组织培养流程继续培养；接种时按每1孔传代4孔的比例接种。
4)直肠癌类癌组织冻存：传代时最后将隐窝离心沉淀前取部分隐窝以供冻存。
5)直肠癌类癌组织复苏：冻存类癌组织从液氮拿出后37℃解冻后离心沉淀，按接种流程继续培养。
最终，培养得到的3个病人的直肠癌类癌组织如图2所示。
优选地，本实施例的培养基选自一下组分。
在一种实施方式中，消化液为消化液为8ml，包含：7mldmem培养基,0.5％胎牛血清，450u/ml胶原酶iv,1.2mg/ml胶原酶ii。
在另一种实施方式中，消化液为消化液为8ml，包含：7mldmem培养基,0.8％胎牛血清，500u/ml胶原酶iv,1.3mg/ml胶原酶ii。
在另一种实施方式中，消化液为8ml，包含：7mldmem培养基,1％胎牛血清，500u/ml胶原酶iv,1.5mg/ml胶原酶ii。
实施例2
在优化和完善直肠癌活检标本类癌组织提取和培养体系后，本发明成功建立了直肠癌类癌组织生物样本库，为后续研究打下了基础。本样本库的类癌组织形态如图3所示，主要包括以下几类：1)空腔型，如a图所示，即圆形类癌组织壁较薄而中间腔体积比较大；2)致密实体型，如b图所示，即圆形类癌组织形态致密中间腔不明显或无中间空腔；3)分化型，如c图所示，即类癌组织周围出芽较多。
如图4所示，可见，本实施例直肠癌类癌组织同时很好地保留了肿瘤的异质性，不同形态类癌组织在同一例患者中同时同在，其中，类癌组织的不同形态代表着其不同的分化能力。
实施例3
以下详细介绍直肠癌类癌组织放疗敏感性及药物敏感性的评估方法。
现有技术均采用细胞活性检测的结果来反应类癌组织接受射线照射后的存活情况。但是本发明发现采用细胞活性检测方法不能真实地反应类癌组织接受射线照射后的存活情况。其理由如图5所示，在剂量-存活曲线中，低剂量区域无明显肩区，与放疗生物学基本原理不符。
本发明经过多次实验发现，类癌组织存活计数较细胞活性检测更能真实反应类癌组织存活情况。本发明根据类癌组织存活计数绘制出的剂量-存活曲线符合放疗生物学原理，如图6所示，在低剂量区存在明显肩部，同时存活计数时间终点应在照射后第九天至第十五天为合适。
进一步实验发现，与患者临床结果相对比，发现除类癌组织剂量-存活曲线可预测临床患者新辅助放化疗疗效外，类癌组织照射或给药后死亡后的面积变化情况也能很好地预测临床患者治疗疗效。因此本发明也利用类癌组织照射或给药后的恢复情况作为放疗敏感性和药物敏感性的评估方法。
因此，本发明用来评估直肠癌类癌组织放疗和药物敏感性的方法包括：类癌组织放疗剂量-存活曲线；类癌组织照射和给药后的恢复情况。其中，类癌组织存活与否标准，如图7所示：左边的图为，16gy照射后第15天类癌组织完整结构被破坏，成散在的细胞团时为类癌组织基本死亡；右边的图为，16gy照射后第15天类癌组织保留完整结构，可见清晰轮廓时为类癌组织存活。
实施例4
以下详细介绍采用实施例1中制造的直肠癌类癌组织以实施例3的评估方法进行放疗敏感性实验，具体实验步骤如下：
1、在基质胶中培养良好的类癌组织传代后接种于48孔板(每个剂量4个复孔)，每孔30ul基质胶。
2、生长1-3天至大小适中、生长状态良好时给予x线照射(x线照射仪器为rad-320，pxi，美国)。照射剂量包括0gy，2gy，4gy，8gy，12gy，16gy。
3、照射后从第六天开始观察拍照，每孔按照右上、左上、左下、右下的顺序紧密衔接拍摄四张照片，基本可覆盖完全。拍照每3天一次。
4、拍照后更换新的培养基。获取照片后使用image-proplus6.0分析照片数据，计数不同剂量下类癌组织存活数量用于剂量-存活曲线制作，勾画和计算8gy照射后不同时间点类癌组织面积评估恢复情况。
实验结果如图8-9所示，在照射后第15天的剂量-存活曲线上不同患者来源的类癌组织存活情况明显分为两群，一群较为敏感，ic50在8gy以下；另一群较为耐受，ic50在10gy以上。根据这个实验结果能得出以下结论：可以通过直肠癌类癌组织的剂量-存活曲线区分本发明的类癌组织放疗敏感性的差异，从而评估原活检组织放疗敏感性的差异。
类癌组织接受8gy照射后的恢复情况观察结果，如图10所示，随着时间延长，不同患者来源的类癌组织照射后死亡和恢复情况有显著差别，部分患者照射后彻底死亡不可再生，部分患者恢复有限，部分患者对射线抵抗恢复较为完全。如图11所示，根据8gy照射后的恢复情况来判断放疗铭感性的标准是：面积(第24天)/面积(第0天)＞100％为放疗抵抗；面积(第24天)/面积(第0天)＜20％为放疗敏感。根据这个实验结果能得出以下结论：可以通过直肠癌类癌组织8gy照射后的恢复情况区分本发明的类癌组织放疗敏感性的差异，从而评估原活检组织放疗敏感性的差异。
实施例5
以下详细介绍采用实施例1中制造的直肠癌类癌组织以实施例3的评估方法进行5-fu药物敏感性实验，具体实验步骤如下：
1、在基质胶中培养良好的类癌组织传代后接种于48孔板(每个剂量4个复孔)，每孔30ul基质胶。
2、生长1-3天至大小适中、生长状态良好给予10μm五氟尿嘧啶(5-fu)处理。处理后从第六天开始观察拍照，拍照方法同上。拍照每3天一次，拍摄至第30天。拍照后更换新的培养基；拍照结果如图12所示。
3、获取照片后使用image-proplus6.0分析照片数据，勾画和计算10μm5-fu处理后不同时间点类癌组织面积，绘制类癌组织面积随时间变化情况，结果如图13所示。
如图13所示：部分患者类癌组织对5-fu敏感，面积随时间变化明显缩小；部分患者类癌组织对5-fu耐受，面积随时间变化缩小不明显或继续增长。根据这个实验结果可以得出以下结论：本发明的直肠癌类癌组织可通过10μm5-fu处理后的面积变化情况区分药物敏感性的差异，从而判断活检组织的药物敏感性差异。
实施例6
以下详细介绍采用实施例1中制造的直肠癌类癌组织以实施例3的评估方法进行cpt-11药物敏感性实验，具体实验步骤如下：
1、在基质胶中培养良好的类癌组织传代后接种于48孔板(每个剂量4个复孔)，每孔30ul基质胶。
2、生长1-3天至大小适中、生长状态良好给予10μmcpt-11处理。处理后从第六天开始观察拍照，拍照方法同上。拍照每3天一次，拍摄至第30天。拍照后更换新的培养基；拍照结果如图14所示。
3、获取照片后使用image-proplus6.0分析照片数据，勾画和计算10μmcpt-11处理后不同时间点类癌组织面积，绘制类癌组织面积随时间变化情况，结果如图15所示。
如图15所示：部分患者类癌组织对5-fu敏感，面积随时间变化明显缩小；部分患者类癌组织对5-fu耐受，面积随时间变化缩小不明显或继续增长。根据这个实验结果可以得出以下结论：本发明的直肠癌类癌组织可通过10μm5-fu处理后的面积变化情况区分药物敏感性的差异，从而判断活检组织的药物敏感性差异。
实施例7
以下详细介绍采用实施例1中制造的直肠癌类癌组织分别进行放疗敏感性实验、5-fu和cpt-11敏感实验结果与患者进行新辅助放化疗疗效评估结果的对比，具体方法如下：
本发明中局部进展期直肠癌活检标本来源于一项iii期临床试验(复旦大学附属肿瘤医院)患者。所有患者均为局部进展期直肠癌患者，在接受新辅助放化疗治疗后(所有患者均有接受x线治疗和5-fu治疗)，大部分患者继续接受手术治疗，少部分患者采用观察等待策略。
手术患者术后都将进行术后病理学检查并对肿瘤退缩程度进行评分(ptrg)，分别为0分(完全反应，即未发现活的肿瘤细胞)，1分(中度反应，即单个或小簇癌细胞残留)、2分(轻度反应，即残留癌灶，间质纤维化)，3分(反应不良，即少数或无肿瘤细胞消退，大量癌残留)。术后病理学评估是评价局部晚期直肠癌新辅助放化疗疗效的金标准。因获得临床完全缓解(ccr)而未行手术治疗无ptrg评分的患者，也被认为对治疗敏感。
采用实施例4和实施例5的方法获得患者直肠癌类癌组织放疗敏感性和药物敏感性数据、患者术后病理学肿瘤退缩程度评分。然后分析本发明的类癌组织放疗敏感性能否可以预测局部晚期直肠癌新辅助治疗的疗效。
1、实施例1中制造的直肠癌类癌组织进行放疗敏感性实验结果与患者进行新辅助放化疗疗效评估结果的对比
实验结果如表一所示，进行17例样本的对比，实验组为表一的第二列，直肠癌类癌组织进行放疗敏感性实验结果；对照组为表一的第三列，局部晚期直肠癌新辅助治疗的疗效。
可见，本发明的类癌组织放疗敏感性(根据8gy照射后恢复情况与剂量-存活曲线判断)预测临床疗效的灵敏度达71.4％，特异度达100％，阳性预测值达100％，阴性预测值达83.3％，诊断效率达88.2％。
表一直肠癌类器官放射敏感性与局部晚期直肠癌患者新辅助治疗的疗效
2、实施例1中制造的直肠癌类癌组织进行5-fu的敏感性实验结果与患者进行新辅助放化疗疗效评估结果的对比
实验结果如表二所示，进行17例样本的对比，实验组为表二的第二列，直肠癌类癌组织进行5-fu的敏感性实验结果；对照组为表二的第三列，局部晚期直肠癌新辅助治疗的疗效。
可见，本发明的类癌组织对5-fu的敏感性预测临床疗效的灵敏度达57.1％，特异度达100％，阳性预测值达100％，阴性预测值达77.0％，诊断效率达82.4％。
表二直肠癌类器官对5-fu的敏感性与局部晚期直肠癌患者新辅助治疗的疗效
3、实施例1中制造的直肠癌类癌组织进行cpt-11敏感性实验结果与患者进行新辅助放化疗疗效评估结果的对比
实验结果如表二所示，进行17例样本的对比，实验组为表三的第二列，直肠癌类癌组织进行cpt-11敏感性实验结果；对照组为表三的第三列，局部晚期直肠癌新辅助治疗的疗效。
可见，本发明的类癌组织对cpt-11敏感性预测临床疗效的灵敏度达100％，特异度达85.7％，阳性预测值达85.7％，阴性预测值达100％，诊断效率达92.3％。
表三直肠癌类器官对cpt-11的敏感性与局部晚期直肠癌患者新辅助治疗的疗效
4、实施例1中制造的直肠癌类癌组织进行放疗敏感性实验和药物敏感性实验结果与患者进行新辅助放化疗疗效评估结果的对比
实际上临床患者接受的是同步放化疗的综合治疗，即在进行放射治疗的同时接受5-fu，或5-fu加cpt-11的同步化疗。因此需要将类癌组织的照射和药物敏感性进行综合分析。
综合对比实验结果如表四所示，进行17例样本的对比，实验组为表四的第二列，直肠癌类癌组织进行x射线和药敏实验结果；对照组为表四的第三列，局部晚期直肠癌新辅助治疗的疗效。
可见，只要患者类癌组织对x射线、5-fu或cpt-11中的任何一个敏感，该患者肿瘤退缩程度几乎都较好(ptrg＝0或1)，即临床疗效佳。综合分析结果表明，直肠癌类癌组织用于预测局部晚期直肠癌新辅助治疗疗效的灵敏度达100％，特异度达90％，阳性预测值达87.5％，阴性预测值达100％，诊断效率达94.1％。
表四直肠癌类器官对x射线和药物的敏感性与局部晚期直肠癌患者新辅助治疗的疗效
本实施例采用实验室实验和临床治疗结果进行对比，从而评价本发明的类癌组织用于评估癌症治疗效果。实验原理及流程图，如图16所示，本实施例实验结果显示，直肠癌活检标本类癌组织放疗和药物敏感性预测患者新辅助放化疗治疗疗效具有很高的准确性，具有广阔的临床应用前景。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。