本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种培养基及其用于建立hbv感染的人源原代肝癌细胞系的方法。
背景技术
现有药物筛选模型一般是基于实验系统来评价药物的药理作用。由于药物筛选要求实验方案标准化且定量化，因而目前较多进行细胞水平的筛选。现有技术多依赖永生化细胞系，或基于细胞系的小鼠异种移植模型。这类平台的优势在于可以大规模扩增细胞以开展高通量筛选实验。但是其缺陷是永生化细胞系由于过表达了sv40、htert等并经过体外长时间培养和传代，它已失去了典型的原代细胞特征，不能充分代表来源个体和组织对于药物处理的敏感性和特异性，所以每年都有数十亿美元花在新靶点药物的iii期临床试验上，但结果往往并不理想。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种培养基，该培养基可用于人源性肝癌细胞的培养，并且经过8次以上传代培养后，仍能检测到hbv核心抗原和表面抗原的表达，为人源原代肝癌细胞系的建立提供了可靠条件。
本发明的第二目的在于提供建立可复制hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系的方法，该方法所建立的原代肝癌细胞系能极大程度地保有肿瘤细胞在体内时的特点，用于药物筛选时对药物处理的反应性较真实；并且该方法体现了个体的特异性，因此为个体病例开展药物筛选提供了技术平台，为肿瘤患者用药提供关键参考。
为了解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种培养基，包括以下成分：
基础培养基，rock抑制剂1～50mm，氢化可的松10～100μg/ml，胰岛素1～10mg/ml，l-谷氨酸50～500mm，青霉素/链霉素；
所述基础培养基为rpmi1640基本培养基或dmem完全培养基。
本发明培养基的核心是加入rock抑制剂以及所有成分的含量。虽然培养基中的每个成分为常规培养基成分，但是各成分的有机组合以及含量并非常规的，本发明正是利用这些特点组成一种适宜培养人源肝癌细胞的培养基，该培养基能够高效建立hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系。本发明的高效特性体现在以下方面：
一、细胞的传代速率快：可在6-8周内传代至7代以上；
二、能够高度保留原代细胞在体内的典型特征：经过8次以上传代培养后，仍能检测到hbv核心抗原和表面抗原的表达。
本发明仅仅列举了以上培养基在建立hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系方面的优势，但本发明对培养基的用途不做限制，其可能用于其他待开拓的领域。
另外，上述培养基还可以从含量以及成分类型上进一步改进，具体如下。
优选地，包括以下成分：
基础培养基，rock抑制剂10～50mm，氢化可的松25～100μg/ml，胰岛素5～10mg/ml，l-谷氨酸50～200mm，青霉素/链霉素。
优选地，包括以下成分：
基础培养基，rock抑制剂10～30mm，氢化可的松25～50μg/ml，胰岛素5～8mg/ml，l-谷氨酸50～100mm，青霉素/链霉素。
优选地，包含：青霉素10,000～15,000u/ml，链霉素10,000～15,000μg/ml。
优选地，所述rock抑制剂为y-27632。
同时，本发明还提供了以上培养基用于建立可复制hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系的方法，包括下列步骤：
收集人体肝细胞癌组织，采用酶消化法或组织贴壁法对其进行原代细胞培养和传代培养，建立人源原代肝癌细胞系；
所述培养采用上文所述的培养基进行。
正如上文所述，由于培养基改良了成分及含量，使其在细胞培养中具有独特优势，因此无论用于酶消化法培养，还是组织贴壁法培养，都能高效建立hbv感染的人源原代肝癌细胞系，为个体化的药物筛选提供有效平台，解决了传统筛选法在iii期临床试验时的资源浪费问题。
同时，上述方法还需在具体的培养条件上进一步改进，具体如下。
优选地，所述酶消化法进行原代细胞培养所用的消化酶为：i型胶原酶，i型胶原酶的加入浓度优选为50～100μg/ml。
优选地，所述原代细胞培养和传代培养的培养条件为：5～6％co2、35～37℃、饱和湿度。
优选地，所述传代培养时：第一代至第三代培养时在培养基中加入8～12％胎牛血清，优选10～12％胎牛血清。
优选地，所述酶消化法进行原代细胞培养的过程为：在含所述i型胶原酶的基础培养基中孵育人体肝细胞癌组织1～3小时，至无肉眼可见组织团块；然后4℃以下离心，去除上清；再以所述基础培养基重悬细胞沉淀，再4℃以下离心去除上清，所得细胞沉淀即以所述培养基培养，使细胞贴壁。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)以人源个体肝癌细胞为基础建立细胞系，用于药物筛选能体现出个体敏感性和特异性，为疾病的防治提供了更准确的依据；
(2)经过多代培养后仍能保留肿瘤细胞在体内时的特点，能检测到hbv核心抗原和表面抗原的表达；
(3)培养速率快，10周内持续培养能传代至10代上，提高了药物筛选效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3无fbs时11#原代肝癌细胞的生长情况；
图2为实施例1有fbs时11#原代肝癌细胞的生长情况；
图3为图2放大后的效果图；
图4为实施例1中14#的消化结果；
图5为实施例1中14#的消化结果；
图6为4#标采用实施例2的方法在第一代培养时的结果；
图7为4#标采用实施例4的方法在第一代培养时的结果；
图8为5#采用实施例5的方法在第三代培养时的结果；
图9为5#采用实施例6的方法在第三代培养时的结果；
图10为5#采用实施例2的方法在第三代培养时的结果；
图11为5#采用实施例7的方法在第三代培养时的结果；
图12为5#采用实施例8的方法在第三代培养时的结果；
图13为12#正常细胞组织中的抗原hbs；
图14为12#癌细胞组织培养至第7代时细胞中的抗原hbs；
图15为12#正常细胞组织中的抗原hbc；
图16为12#癌细胞组织培养至第7代时细胞中的抗原hbc。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例方式的基础在于采用以下培养基建立可复制hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系：
一种培养基，包括以下成分：
基础培养基，rock抑制剂1～50mm，氢化可的松10～100μg/ml，胰岛素1～10mg/ml，l-谷氨酸50～500mm，青霉素/链霉素；
所述基础培养基为rpmi1640基本培养基或dmem完全培养基。
该培养基的核心是加入rock抑制剂以及所有成分的含量。虽然培养基中的每个成分为常规培养基成分，但是各成分的有机组合以及含量并非常规的，本发明正是利用这些特点组成一种适宜培养人源肝癌细胞的培养基，该培养基能够高效建立hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系。本发明的高效特性体现在以下方面：
一、细胞的传代速率快：可在6-8周内传代至7代以上；
二、能够高度保留原代细胞在体内的典型特征：经过8次以上传代培养后，仍能检测到hbv核心抗原和表面抗原的表达。
在实际培养过程中，rock抑制剂、氢化可的松、胰岛素、l-谷氨酸、青霉素/链霉素的浓度对细胞的生长速率、分化程度、细胞活性、保留体内细胞特点的程度均有差异。通常，rock抑制剂、氢化可的松、胰岛素、l-谷氨酸取上述范围内的任意浓度，均可实现上述效果。例如，rock抑制剂的浓度可以为1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm等，氢化可的松可以为10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml等，胰岛素可以为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml等，l-谷氨酸可以为50mm、60mm、80mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm、450mm、500mm等。
经过筛选，优选的配方为：
基础培养基，rock抑制剂10～50mm，氢化可的松25～100μg/ml，胰岛素5～10mg/ml，l-谷氨酸50～200mm，青霉素/链霉素。
或者，
基础培养基，rock抑制剂10～30mm，氢化可的松25～50μg/ml，胰岛素5～8mg/ml，l-谷氨酸50～100mm，青霉素/链霉素。
筛选青霉素/链霉素的浓度，优选青霉素10,000～15,000u/ml，链霉素10,000～15,000μg/ml。
还对rock抑制剂的类型进行了筛选，优选y-27632，其属于可逆性的rock小分子抑制剂，如筛药过程中需使用该分子拮抗剂，可暂停使用y-27632，而对细胞状态无致命性影响。
采用以上培养基建立可复制hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系时，采用贴壁法培养细胞，分离原代细胞的方式是任意的，例如组织贴壁法或酶消化法，两种方法处理原代细胞的步骤和条件存在区别。
以酶消化法为例，优选采用i型胶原酶消化细胞组织，加入浓度优选为50～100μg/ml，处理过程为：
在含所述i型胶原酶的基础培养基中孵育人体肝细胞癌组织1～3小时，至无肉眼可见组织团块；然后4℃以下离心，去除上清；再以所述基础培养基重悬细胞沉淀，再4℃以下离心去除上清，所得细胞沉淀即以所述培养基培养，使细胞贴壁，之后传代培养。
该处理的基本流程是酶解反应——离心——重悬——离心——培养。
两次离心的速率优选300g～500g。在第二次离心之前优选将细胞悬液用70μm细胞筛网过滤至离心管中。
以组织贴壁法为例，其对细胞组织的处理过程为：
组织块剪至约10mm3，均匀加至六孔板中含有500μlfbs的孔板中，静置4小时后，沿板壁缓慢加入1ml基础培养基，勿晃动已贴壁组织块。
其中，组织块的体积、fbs和基础培养基的加入量以及静置时间可以适应性调整。
无论是组织贴壁法还是酶消化法，在培养时均优选采用以下培养条件：
5～6％co2、35～37℃、饱和湿度。
另外，本发明发现在第一代至第三代培养时在培养基中加入8～12％胎牛血清后，细胞的生长速度加快，并且能保持更高的成活率。更优选的，加入10～12％胎牛血清。
实施例1
组织贴壁法建立可复制hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系
第一步、留存肝切除手术中的肝细胞癌组织标本，标注id号后所有后续操作于冰上或4℃开展。于无菌条件下分离hcc肿瘤组织，将坏死组织、血管、结缔组织等剥除干净。
第二步、组织块剪至约10mm3，均匀加至六孔板中含有500μlfbs的孔板中，静置4小时后，沿板壁缓慢加入1毫升dmem完全培养基，勿晃动已贴壁组织块。
第三步、培养细胞，所用培养基配方：dmem完全培养基，rock抑制剂10mm，氢化可的松25μg/ml，胰岛素5mg/ml，l-谷氨酸200mm，青霉素10,000u/ml，链霉素10,000μg/ml；培养条件：5％co2、37℃、饱和湿度；
期间，每日换液,每2-4d用0.25％胰蛋白酶消化，1︰3比例传代培养,取对数生长期的细胞用于实验。将细胞按照3×105细胞/每孔的密度接种于6孔细胞培养板中,形成单层贴壁细胞，并设平行组用于判断实验过程中细胞活性，保证实验用细胞百分存活率在97％以上。其中，第一代至第三代培养时加入10％fbs(胎牛血清)。
结果：采用该方法培养的所有病例细胞，均可在一周内获得1×105的细胞数量，并且在6-8周内可传代至7代以上。
实施例2
酶消化法建立可复制hbv感染状态的人源原代肝癌细胞系
第一步、留存肝切除手术中的肝细胞癌组织标本，标注id号后所有后续操作于冰上或4℃开展。于无菌条件下分离hcc肿瘤组织，将坏死组织、血管、结缔组织等剥除干净。
第二步、
用预冷pbs洗涤三次后，将组织剪碎约至细沫状。将组织置于无菌ep管中，并加入1毫升加入dmem完全培养基和i型胶原酶，使终浓度为50μg/ml。封口后于37℃水浴锅中摇动孵育1-3小时，至无肉眼可见组织团块。4℃低速500g离心5分钟，去除上清。以dmem完全培养基10毫升重悬细胞沉淀，将细胞悬液用70μm细胞筛网过滤至新的50毫升离心管中，再次于300g离心5分钟后倾去上清，所得细胞沉淀即以相应配方培养基重悬均匀后，于5％co2的37度培养箱中静置培养，前24小时勿晃动，使细胞充贴壁。相应配方培养基指：dmem完全培养基，rock抑制剂10mm，氢化可的松25μg/ml，胰岛素5mg/ml，l-谷氨酸200mm，青霉素/链霉素，青霉素10,000u/ml，链霉素10,000μg/ml；培养条件为：5％co2、37℃、饱和湿度。
在培养和传代期间，每日换液,每2-4d用0.25％胰蛋白酶消化，1︰3比例传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。将细胞按照3×105细胞/每孔的密度接种于6孔细胞培养板中，形成单层贴壁细胞,并设平行组用于判断实验过程中细胞活性，保证实验用细胞百分存活率在97％以上。其中，第一代至第三代培养时加入10％fbs(胎牛血清)。
结果：采用该方法培养的所有病例细胞，均可在一周内获得1×105的细胞数量，并且在6-8周内可传代至7代以上。
实施例3
第一步、留存肝切除手术中的肝细胞癌组织标本，标注id号后所有后续操作于冰上或4℃开展。于无菌条件下分离hcc肿瘤组织，将坏死组织、血管、结缔组织等剥除干净。
第二步、组织块剪至约10mm3，均匀加至六孔板中含有500ulfbs的孔板中，静置4小时后，沿板壁缓慢加入1毫升dmem完全培养基，勿晃动已贴壁组织块。
第三步、培养细胞，所用培养基配方：dmem完全培养基，rock抑制剂10mm，氢化可的松25μg/ml，胰岛素5mg/ml，l-谷氨酸200mm，青霉素10,000u/ml，链霉素10,000μg/ml；培养条件：5～6％co2、35～37℃、饱和湿度；
期间，每日换液,每2-4d用0.25％胰蛋白酶消化,1︰3比例传代培养,取对数生长期的细胞用于实验。将细胞按照3×105细胞/每孔的密度接种于6孔细胞培养板中,形成单层贴壁细胞,并设平行组用于判断实验过程中细胞活性，保证实验用细胞百分存活率在97％以上。其中，传代培养时不加入fbs。
结果：采用该方法培养的所有病例细胞，均可在一周内获得1×105的细胞数量，并且在6-8周内可传代至7代以上。
实施例4
与实施例2的区别仅在于所用的基础培养基不同，为rpmi1640基本培养基，具体过程如下。
第一步、留存肝切除手术中的肝细胞癌组织标本，标注id号后所有后续操作于冰上或4℃开展。于无菌条件下分离hcc肿瘤组织，将坏死组织、血管、结缔组织等剥除干净。
第二步、
用预冷pbs洗涤三次后，将组织剪碎约至细沫状。将组织置于无菌ep管中，并加入1毫升加入rpmi1640基本培养基和i型胶原酶，使终浓度为50μg/ml。封口后于37℃水浴锅中摇动孵育1-3小时，至无肉眼可见组织团块。4℃低速500g离心5分钟，去除上清。以rpmi1640基本培养基10毫升重悬细胞沉淀，将细胞悬液用70μm细胞筛网过滤至新的50毫升离心管中，再次于300g离心5分钟后倾去上清，所得细胞沉淀即以相应配方培养基重悬均匀后，于5％co2的37度培养箱中静置培养，前24小时勿晃动，使细胞充贴壁。相应配方培养基指：rpmi1640基本培养基，rock抑制剂10mm，氢化可的松25μg/ml，胰岛素5mg/ml，l-谷氨酸200mm，青霉素/链霉素，培养条件为：6％co2、35℃、饱和湿度。
在培养和传代期间，每日换液,每2-4d用0.25％胰蛋白酶消化，1︰3比例传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。将细胞按照3×105细胞/每孔的密度接种于6孔细胞培养板中，形成单层贴壁细胞,并设平行组用于判断实验过程中细胞活性，保证实验用细胞百分存活率在97％以上。其中，第一代至第三代培养时加入12％fbs(胎牛血清)。
结果：采用该方法培养的所有病例细胞，均可在一周内获得1×105的细胞数量，并且在6-8周内可传代至7代以上。
实施例5至8
实施例5至8与实施例2的区别仅在于所用的y27632浓度不同，分别为1mm、5mm、20mm、50mm，其余步骤及条件均相同。
实施例9
与实施例2的区别在于原代培养和传代培养时所用的培养基不同，本实施例所用的配方为：
dmem完全培养基，rock抑制剂1mm，氢化可的松10μg/ml，胰岛素1mg/ml，l-谷氨酸50mm，青霉素10,000u/ml，链霉素10,000μg/ml。
其余过程均与实施例2相同。
实施例10
与实施例2的区别在于原代培养和传代培养时所用的培养基不同，本实施例所用的配方为：
dmem完全培养基，rock抑制剂50mm，氢化可的松100μg/ml，胰岛素10mg/ml，l-谷氨酸500mm，青霉素10,000u/ml，链霉素15,000μg/ml。
其余过程均与实施例2相同。
比较实施例1和3有无fbs对细胞生长的影响，结果如图1至3所示，图1代表实施例3无fbs时11#原代肝癌细胞的生长情况，图2代表实施例1有fbs时11#原代肝癌细胞的生长情况，图3为图2放大后的效果图。从图中可明显看出，有fbs时原代肝癌细胞的生长速度快，状态良好，分散效果好。
比较实施例1与实施例2不同分离法对细胞的消化效率，同一标本(14#)经同样步骤做坏死组织剥离和修剪后，分别进行组织贴壁培养法，或经胶原酶法获得单个细胞后贴壁培养。72小时后，胶原酶法相较组织贴壁法而言，明显获得更多的细胞数量，得率更高，图4为实施例1的消化结果，图5为实施例2的消化结果。
比较实施例2与4基础培养基对细胞生长的影响，结果如图6-7所示，图6为4#标本采用实施例2的方法在第一代培养时的结果，图7为4#标本采用实施例4的方法在第一代培养时的结果，结果显示dmem高糖培养基更利于肝实质细胞和肝癌肿瘤细胞的生长与增殖。
比较实施例2、5至8中培养基y27632浓度对细胞生长的影响，结果显示该培养基配方中的关键成分rock抑制剂y27632的最佳使用浓度为10mm，呈现最显著的促肝癌原代细胞增殖的能力，图8至12分别代表实施例5、6、2、7、8的培养结果(第三代，5#标本)。
另外，以上实施例培养过程中，还检测了p5代次后hbv抗原在原代肿瘤细胞传代中的变化，发现无论是肝癌原代细胞还是癌旁的原代肝细胞中，均可检测到hbv病毒表面抗原和核心抗原的显著表达，图13和图14列举了实施例2的抗原hbs变化，图15和图16列举了实施例2的抗原hbc变化，图13为12#正常细胞组织中的抗原hbs，图14为癌细胞组织培养至第7代时细胞中的抗原hbs，图15为12#正常细胞组织中的抗原hbc，图16为癌细胞组织培养至第7代时细胞中的抗原hbc。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。