一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用与流程

本发明属于基因工程技术领域；具体涉及t淋巴细胞的改造；更具体的,涉及利用crispr-cpf1系统制备阻断免疫检查点t细胞及制得的t细胞及其应用。

技术背景

恶性肿瘤发病率和死亡率高居不下，是威胁人类健康的头号杀手，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。近年来，随着基因工程技术的发展，对于免疫调节机制认识的加深，以及更多抗肿瘤免疫调节药物的实验数据支持，免疫检查点治疗药物已成为对抗肿瘤的新手段。

免疫检查点阻断成为细胞免疫治疗的研究热点，也是当前靶向基因治疗最成功的的领域,免疫检查点控制共刺激和共抑制信号的平衡，而免疫检查点的平衡使t细胞的免疫效应保持适当的深度、广度，从而最大程度减少对于周围正常组织的损伤，维持对自身组织的耐受、避免自身免疫反应。然而，肿瘤细胞可异常上调共抑制分子及其相关配体，抑制t细胞的免疫活性，进而造成免疫逃逸。目前，针对肿瘤的免疫治疗研究的热点，且较为成熟的免疫检查点有：细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白(t-lymphocyteantigen-4,ctla-4)、程序性死亡受体-1(programmeddeath-1，pd-1)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyteactivationgene-3,lag-3)、t细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3(t-cellimmunoglobulinandmucin-3)等。其中pd-1的主要功能是限制外周组织的效应t细胞活性，肿瘤细胞表达的pd-1配体和t细胞的pd-1结合，抑制体细胞激活相关激酶，从而抑制效应t细胞活性；ctla-4主要表达在活化的t细胞或自然杀伤细胞中，当与抗原呈递细胞表面的b7-1(cd80)/b7-2(cd86)结合后，ctla-4可以负向调节t细胞的活化，导致t细胞应答的下调；tim-3是免疫调节分子tim家族成员，为ⅰ型跨膜糖蛋白，高表达于th1和细胞毒性t细胞(tc1)上，与其配体半乳糖凝集素-9(galectin-9)相互作用时，可导致th1和tc1的细胞凋亡；lag-3属于免疫球蛋白超家族，主要表达于活化的t细胞和nk细胞表面，与mhc-ⅱ亲和力高，当与配体结合后可抑制th1细胞增殖和ifn-γ、il-2和tnf-α等细胞因子的分泌，同时lag-3同样能抑制cd8⁺t细胞活性，抑制细胞毒性作用。

免疫检查点的阻断，则是指利用t细胞免疫检查抑制性受体的单克隆抗体，特异性阻断抑制性受体与其配体的结合，从而阻断免疫检查机制抑制t细胞活化的作用，增强效应t细胞的抗肿瘤效果。免疫检查点抑制剂治疗除ctla-4、pd-1、pd-l1外，新的免疫检查点如lag3、tim-3、vista、a2ar、cd160等的研究也在不断的进行中，然而，当前临床上阻断性抗体也具有其不可避免的缺陷，如：抗体作用只是暂时阻断的作用；抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体还没有对策；不容易研发出有效的抗体；只针对细胞外靶点；抗体药物昂贵；抑制剂总体缓解率相对较低；长期应用免疫检查点抑制药可使免疫耐受性不平衡导致免疫检查点无检查点免疫反应等。

为解决上述药物制剂的弊端，已有中国专利cn201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向pd-1基因的sgrna，利用crispr-cas9技术，达到特异性敲除pd-1基因的目的。

再如中国专利cn201710991908.7公开了一种编码抗bcma嵌合抗原受体的基因和包含有该基因重组表达载体，还公开了一种靶向骨髓瘤bcma抗原的转基因t细胞，其制备方法：grna、crispr-cas9mrna、hdr混合，电转重组t细胞，该发明在car-t构建中，引入了egfr的识别序列，必要时可用egfr单抗cetuximab消除car-t细胞，并且敲除了pd1、ctla4基因，解除了其对cart细胞的抑制，增强了car-t细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

虽然crispr-cas9及其衍生技术被誉为人类改写生命代码的“神笔”，近年来为生物领域也带来了巨大的冲击，在2013年更被science杂志评为十大科学突破之一，利用crispr-cas9技术，科学家们能够高效、精确地对dna序列进行修剪、替换或添加，可以快速地实现微生物基因组编辑、动植物的品种优化、动物模型构建，甚至推动疾病治疗的颠覆性革命。然而，随着研究的不断深入，crispr-cas9也暴露了它的缺陷和局限性，如严重的脱靶效应，因此，科学家们也致力于寻找新的基因编辑系统，2015年麻省理工学院张峰小组报道了一种新的2类v型crispr效应蛋白cpf1，是在单链向导rna引导下与靶dna特定位点结合并切割的核酸内切酶，而crispr-cpf1的开发将有利于突破和克服crispr-cas9应用中的一些限制，与crispr-cas9相比crispr-cpf1具有以下优势：cpf1的分子量比cas9小，更易进入细胞；cas9和cpf1均是单链rna指导的核酸内切酶，但cas9只具有dna内切酶活性，而cpf1同时具有dna和rna内切酶活性；crispr-cas9初级转录产物pre-crrna的成熟需要反式激活crrna(trans-activatingcrrna，tracrrna与crrna互补配对，在cas9存在的条件下，由rnaseⅲ加工完成，而crispr-cpf1的初级转录产物pre-crrna由cpf1自身加工，不需要tracrrna的参与；crispr-cas9将crrna和tracrrna融合成一条sgrna(single-guiderna)，可以引导cas9割dna，其中sgrna长度一般大于100nt，靶定不同的基因需要设计不同的sgrna，而crispr-cpf1中，cpf1剪切dna所需的crrna长度仅为42-44nt，只需要替换crispr中的间隔序列就可以靶定不同基因，实现多个基因的同时编辑；cas9识别位于靶序列的3′端的富含胞嘧啶(g)的pam序列(5′-ngg-3′)，而cpf1识别位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶(t)的pam序列，cpf1识别的pam序列与cas9不同，极大地扩宽了crispr系统基因组编辑的靶点范围，尤其是富含at的基因组cas9剪切位点离pam序列很近，在其上游第3个核苷酸处进行切割，若发生nhej修复，造成的核苷酸插入或缺失会改变pam临近序列，导致cas9无法再次识别和切割靶位点从而阻碍同源重组修复在靶位点引入正确的基因编辑，而cpf1的剪切位点离pam序列较远，在靶dna链的pam序列下游第23位核苷酸和非靶dna链的第18位核苷酸处进行切割，nhej修复造成的核苷酸插入或缺失，不会改变pam临近序列，cpf1仍然可以识别和切割靶基因，同源重组修复依然可以在靶位点引入正确的基因编辑；cas9切割dna形成一个平末端，而cpf1切割dna形成一个有5个核苷酸突出的黏性末端等。

为了解决crispr-cas9在用于t细胞改造中所显示出的缺陷和局限性，本发明提供一种更加精确特异性更强的针对t细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法，并提供相应的技术方案，达到特异性敲除t细胞免疫检测点通路进行基因的目的。

技术实现要素：

针对现有临床上阻断性抗体进行免疫检测阻断治疗肿瘤存在的问题：(1)抗体作用只是暂时阻断的作用；(2)抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体；(3)不容易研发出有效的抗体；(4)只针对细胞外靶点；(5)抗体药物昂贵；(6)抑制剂总体缓解率相对较低；(7)长期应用免疫检查点抑制药可使免疫耐受性不平衡导致免疫检查点无检查点免疫反应等。

本发明提供了一种对t细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法：明确t细胞免疫检测点通路基因的目标dna区域，根据选定的目标dna区域，设计sgrna引物对，并利用crispr-cpf1系统达到特异性定向敲除t细胞免疫检测点通路基因的目的。

上述方法中，所述的t细胞免疫检测点通路基因可以为程序性死亡受体-1基因(programmeddeath-1，pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白基因(t-lymphocyteantigen-4，ctla-4)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyteactivationgene-3,lag-3)或t细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3基因(t-cellimmunoglobulinandmucin-3，tim3)。

本发明还提供了4组sgrna引物对分别针对以上4种t细胞免疫检测点通路基因，具体为：

本发明提供了一种利用crispr-cpf1/sgrna快速、简单、高效、特异性敲除t细胞免疫检测点通路基因的方法，有效解决了利用crispr-cas9系统对pd-1、ctla-4、lag-3和tim3基因敲除的缺陷：(1)直接敲除t细胞免疫检测点通路基因，可以实现永久的效果；(2)既可针对pd-1的多个编码序列进行敲除，也可以针对多个靶基因进行敲除；(3)提供高效的sgrna；(4)既可以针对胞外，也可以针对胞内靶点；(5)sgrna只需要少量合成多核苷酸片段，就能大批量生产；(6)可以突破和克服crispr-cas9应用中的一些限制，如严重的脱靶效应。

具体地，本发明提供了一种利用crispr-cpf1系统敲除t细胞免疫检测点通路基因的方法。

一种利用crispr-cpf1系统制备基因敲除t细胞的方法，包括以下步骤：

(1)sgrna寡核苷酸的设计和构建；

(2)sgrna的功能验证；

(3)pbmc细胞的制备；

(4)基因敲除t细胞的制备。

进一步地，所述步骤(1)中sgrna寡核苷酸的设计和构建，具体步骤为：

1)明确t细胞免疫检测点通路基因目标dna区域，选定具有cpf1核酸酶蛋白识别pam位点特征区域为特异性靶序列；

2)按照步骤1)选定的特异性靶序列，合成sgrna引物对，引物对包含：具有5’-agat-nx-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-aaaa-nx-3’特征的反向寡核苷酸链，退火形成双链dna；

3)对pgl3-u6-sgrna质粒进行线性化；

4)将步骤2)获得的双链dna和3)获得的线性化的pgl3-u6-sgrna质粒进行连接，得连接产物；

5)将步骤4)中所获得的连接产物转化dh5α感受态细胞并凃平板，挑取克隆测序，测序结果正确的克隆即为含有sgrna质粒的克隆。

进一步的，所述步骤(2)sgrna功能验证，具体步骤为：

1)细胞培养与转染，将hek293t细胞接种于细胞培养板中，待细胞长到培养板的70-80％时，将步骤(1)得到的sgrna质粒和sgcpf1质粒共转染至hek293t细胞中，然后药杀48小时后收集细胞；

2)t7en1酶切检测，将步骤1)中收集的细胞进行dna提取，并在sgrna位点上下游设计引物f和引物r，并用引物f和引物r对所提取的dna进行pcr扩增，得pcr扩增产物，然后对pcr扩增产物进行纯化回收，得pcr回收产物，取回收产物进行t7en1酶切，然后进行琼脂糖胶进行电泳检测；

3)t-a克隆测序，将t7en1酶切检测后的pcr回收产物进行t-a克隆，，挑取单克隆，并测序验证。

进一步地，所述步骤(4)基因敲除t细胞的制备，具体步骤为：

1)将步骤(1)得到的sgrna质粒和sgcpf1质粒共转染步骤(3)获得的pbmc细胞；

2)采用偶联cd3/cd28抗体的磁珠富集cd3阳性t细胞；

3)筛选并培养步骤2)扩增转染后的阳性t细胞，获得基因敲除t细胞。

其中，步骤(1)-1)中所述的t细胞免疫检测点通路基因可以为程序性死亡受体-1基因(programmeddeath-1，pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白基因(t-lymphocyteantigen-4，ctla-4)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyteactivationgene-3,lag-3)或t细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3基因(t-cellimmunoglobulinandmucin-3，tim3)。

其中，步骤(1)-1)中所述的特异性靶序列，具体为选择pam结构3＇端相邻的18-25bpdna序列作为靶序列，其中pam位点特征5’-tttn-3’，n表示a、g、c、t中的任一种；

其中，步骤(1)-2)中所述的具有5’-agat-nx-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-aaaa-nx-3’特征的反向寡核苷酸链中的n代表a、g、c、t中的任一种；x为整数，且18≤x≤25，其中所述正向寡核苷酸链中的nx和反向寡核苷酸中的nx具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；

进一步地，步骤(1)-2)中所述的sgrna引物对为：

其中，步骤(1)-5)中的平板为包括50μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的平板；

其中，步骤(2)-1)中的所述的共转染使用脂质体转染试剂，具体为lipofectamine^tm2000transfectionreagent；

其中，步骤(2)-1)中所述的药杀选用杀稻瘟菌素(blasticidin)和嘌呤霉素(puromycin)；

其中，步骤(2)-1)中所述的sgcpf1为编码cpf1蛋白酶的质粒，该质粒与sgrna共转染细胞，表达的cpf1蛋白指导sgrna完成对靶基因的敲除编辑。

本发明还提供了由上述方法制备得到的基因敲除t细胞，所述的基因敲除t细胞为pd-1基因敲除t细胞、ctla4基因敲除t细胞、lag3基因敲除t细胞或tim-3基因敲除t细胞；

以及，上述四种基因敲除t细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

相比于现有技术利用免疫检查点阻断治疗肿瘤，本发明的优点在于：

(1)直接敲除t细胞免疫检测点通路基因，可以实现永久的效果；

(2)可针对pd-1的多个编码序列进行同时敲除，也可以针对多个靶基因进行同时敲除；

(3)提供高效的sgrna；

(4)既可以针对胞外，也可以针对胞内靶点；

(5)sgrna只需要少量合成多核苷酸片段，就能大批量生产；

(6)可以突破和克服crispr-cas9应用中的一些限制和缺陷，如严重脱靶效应；

(7)该方法简单易行，免疫检查点敲除t细胞有效性更好，安全性更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例4中特异性敲除pd1基因的pgl3-pd1(sg)载体结构图。

图2为本发明中使用的特异性敲除ctla-4基因的pgl3-ctla-4(sg)表达载体的基因结构图；

图3为本发明中使用的特异性敲除lag-3基因的pgl3-lag-3(sg)表达载体的基因结构图；

图4为本发明中使用的特异性敲除tim-3基因的pgl3-tim-3(sg)表达载体的基因结构图；

图5为本发明中使用的pst1374-h13lb-cpf1的基因结构图；

图6为实施例4中的凝胶电泳图。

图7为实施例5中的流式检测cfse的荧光信号图。

图8为实施例6中的吸光度检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步的详细说明本发明，需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制，本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1sgrna设计和构建

(1)sgrna引物对设计

选定t细胞免疫检测点通路基因目标dna区域，t细胞免疫检测点通路基因分别为：细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白(t-lymphocyteantigen-4,ctla-4)、程序性死亡受体-1(programmeddeath-1，pd-1)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyteactivationgene-3,lag-3)、t细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3(t-cellimmunoglobulinandmucin-3，tim-3)，依据选定的靶序列，每个目的基因分别合成了一对sgrna，序列如下：

(2)将上表中的每对sgrna变性退火

退火体系为：

在pcr仪中按照以下降落pcr程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；4℃，保存。

(3)pgl3-u6-sgrna质粒线性化

酶切体系和条件如下：

8μgpgl3-u6-sgrna(400ng/μl)；

5μlcutsmartbuffer；

5μlbsai(neb，r0535l)；

补水至50μl，37℃孵育3小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上，酶切完成后用pcr纯化试剂盒axypreppcrcleanupkit(ap-pcr-250)纯化回收至30μl灭菌水中。

(4)将变性、退火之后获得的4组双链sgrna寡聚核苷酸分别与线性化的pgl3-u6-sgrna质粒相连，转化；

连接体系如下：

16℃连接1小时，将连接产物转化dh5α感受态细胞并涂含50μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的平板上，然后挑取克隆测序，测序鉴定引物：用assemblyfor:cgattagtgaacggatctcgacg测序鉴定获得阳性克隆。

(5)37℃摇床摇菌(250ml)过夜培养阳性克隆，并用试剂盒(invitrogen,k210015)抽提质粒，质粒浓度控制在1.5μg/μl。

实施例2sgrna的功能验证

(1)细胞培养与转染

1)hek293t细胞接种培养于dmem高糖培养液中(hyclone,sh30022.01b)，其中含10％fbs，青霉素(penicillin，100u/ml)和链霉素(streptomycin，100μg/ml)；

2)在转染前将hek293t细胞接种于12孔板中，待细胞长到12孔板的70％～80％密度时，换成无抗生素培养基，准备转染；

3)按照lipofectamine^tm2000transfectionreagent(invitrogen，11668-019)的操作手册，将0.5μgpgl3-u6-hpd1sg1与1.5μg的pst1374-h13lb-cpf1质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6小时后换液，并加入杀稻瘟菌素(blasticidin，invitrigen,ant-bl-1)和嘌呤霉素(puromycin,invitrigen,ant-pr-1)药筛，48小时后收取细胞。

(2)t7en1酶切检测

1)将收集的细胞进行dna提取，并在sgrna位点上下游设计引物f和引物r，用引物f和引物r对所提取的dna进行pcr扩增，并对pcr产物进行纯化回收；

2)取200ng纯化回收产物统一稀释到20μl进行变性、退火，pcr程序为：95℃，5min；95–85℃at-2℃/s；85–25℃at-0.1℃/s；4℃，保存；

3)在20μl体系中加入t7en10.3μl，混匀后37℃酶切30分钟，加入2μl10xloadingbuffer，用3％的琼脂糖胶电泳检测；

(3)ta克隆测序

将t7en1酶切检测步骤c获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应，加a反应体系为：

37℃温育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector连接并转dh5α感受态细胞，挑取单克隆，用通用引物m13f测序；

实施例3pbmc细胞的制备

用抗凝管采集健康人外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合；将抗凝血缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(ficoll)的50ml离心管中，450g，慢升慢降离心25min，中间不能停止离心，离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50ml离心管中，加入pbs，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入pbs，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入pbs，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到pbmc细胞。

实施例4特异性敲除pd-1基因制备pd-1敲除t细胞

将实施例3制得的pbmc用含10％fbs的aim-v培养基(含il-2细胞因子)进行培养，待细胞激活一段时间后细胞数目达到3×10⁷个；

如附图1所示crispr-cpf1特异性敲除人pd-1基因的载体，将特异性靶向pd1基因(其核苷酸序列如seqidno.1所示)的sgrna(其骨架核苷酸序列如seqidno.6所示)连接在线性的pgl3-u6-sgrna质粒上，与pst1374-h13lb-cpf1质粒(其核苷酸序列如seqidno.5所示)一起成功转染cd3阳性t细胞即可实现pd1基因的敲除，具体步骤为：

将上述2种质粒各5μg与amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，获得包含该2种质粒的100μl电转混合液，其中原始质粒pgl3-u6-sgrna、pst1374-h13lb-cpf12个质粒作为对照；将所述两组电转混合液加入3×10⁷个pbmc细胞中进行电转；细胞转染2h后换液，采用偶联cd3/cd28抗体的磁珠富集cd3阳性t细胞；转染6天后加入0.5μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)，筛选并培养扩增转染后的t细胞，而获得t细胞；随后提取t细胞基因组dna，并用提前设计好的检测引物进行检测，pcr扩增目的片段，纯化回收，使用t7en1酶切检测突变体，3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切，结果如图6凝胶电泳图所示，将pcr产物连接进t载体中，转化进dh5α，随机挑取21个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。结果显示，21个克隆中有9个克隆为正确的单碱基编辑，其正确编辑率为：42.86％。

实施例5特异性敲除ctla-4基因制备ctla-4敲除t细胞

该实施例的方法和步骤同实施例4基本相同，唯一的区别在于，将特异性靶向ctla-4基因(其核苷酸序列如seqidno.2所示)的sgrna连接在线性的pgl3-u6-sgrna质粒上，与pst1374-h13lb-cpf1质粒一起成功转染cd3阳性t细胞即可实现ctla-4基因的敲除，得如附图2所示的pgl3-ctla-4(sg)表达载体。

随机挑取21个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。结果显示，21个克隆中有10个克隆为正确的单碱基编辑，其正确编辑率为：47.62％。

实施例6特异性敲除lag-3基因制备lag-3敲除t细胞

该实施例的方法和步骤同实施例4基本相同，唯一的区别在于，将特异性靶向lag-3基因(其核苷酸序列如seqidno.3所示)的sgrna连接在线性的pgl3-u6-sgrna质粒上，与pst1374-h13lb-cpf1质粒一起成功转染cd3阳性t细胞即可实现lag-3基因的敲除，得如附图3所示的pgl3-lag-3(sg)表达载体

随机挑取21个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。结果显示，21个克隆中有9个克隆为正确的单碱基编辑，其正确编辑率为：42.86％。

实施例7特异性敲除tim-3基因制备tim-3敲除t细胞

该实施例的方法和步骤同实施例4基本相同，唯一的区别在于，将特异性靶向tim-3基因(其核苷酸序列如seqidno.4所示)的sgrna连接在线性的pgl3-u6-sgrna质粒上，与pst1374-h13lb-cpf1质粒一起成功转染cd3阳性t细胞即可实现tim-3基因的敲除，得如附图4所示的pgl3-tim-3(sg)表达载体。

随机挑取21个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。结果显示，21个克隆中有11个克隆为正确的单碱基编辑，其正确编辑率为：52.38％。

实施例8pd-1敲除t细胞增殖能力检测

分别培养使用crispr-cpf1和crispr-cas9靶向敲除pd-1制备的pd-1敲除t细胞以及raji细胞。

将raji细胞经70gy辐照射，取1×10⁵个raji细胞，铺于24孔板中；t细胞pbs洗两次后，用5μmcfse的pbs染色，在培养箱中孵育5min；用含血清的培养基清洗2次后，按照效靶比10:1的比例，将crispr-cpf1和crispr-cas9靶向敲除pd-1制备的pd-1敲除t细胞加入到24孔板中与肿瘤细胞共培养，连续培养一周，自72小时开始，每天流式检测cfse的荧光信号(如附图7所示)，依据cfse荧光信号强度可推测细胞的增殖能力，pd-1敲除后不影响t细胞的增殖。

实施例9pd1敲除t细胞杀伤效果评估

分别培养raji细胞和效应细胞pd1-敲除t细胞(cd19-car/pd-1^ko)、t细胞(cd19-caralone)、对照t细胞(nt)，收集靶细胞raji4×10⁵个细胞和效应细胞(t细胞)各3×10⁶个细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清，再用1mlpbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清，重复以上步骤一次，并用700μl培养基(aim-v培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞。

设置效靶比为0.5:1、1:1、5:1、10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5％co2培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作)，室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度，结果如附图8所示，pd1-敲除t细胞在raji靶细胞中不同效靶比条件下杀伤效率明显高于普通的t细胞。

序列表

<110>苏州茂行生物科技有限公司

<120>一种对t细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用

<130>20180723

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>1

gcacgaagctctccgatgtgttg23

<210>2

<211>23

<212>dna

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ttctcttcatccctgtcttctgc23

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>3

tgcagccgctttgggtggctcca23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>4

acatcttccctttgactgtgtcc23

<210>5

<211>8768

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>5

gatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgc60

atagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgag120

caaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttag180

ggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgatt240

attgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatgga300

gttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccg360

cccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattg420

acgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatca480

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