本公开涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及一种制备可实时检测间充质干细胞衰老的细胞模型的方法。
背景技术：
间充质干细胞(msc,mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞。人间充质干细胞(mscs)作为一种新型基因治疗的靶细胞有着广泛床应用前景。mscs作为基因工程细胞其优势如下：(1)来源广泛，可从自体或异体获得，属于同种移植，不涉及伦理问题；(2)易于培养，具有增殖能力，体内外均保持多向分化潜能；(3)具有归巢组织损伤部位、分泌大量细胞因子的能力。但是，mscs在体外连续传代后所出现的细胞增殖能力的下降、细胞体积变大等细胞衰老现象；当间充质干细胞移植至体内不同组织后，处于疾病或衰老的组织微环境中，组织特异性的细胞因子及有害代谢产物可能会影响间充质干细胞在体内的衰老而影响细胞体内存活时间与功能。上述mscs的衰老现象限制了其作为细胞移植药物的临床应用。间充质干细胞的衰老程度可以通过衰老相关基因的表达进行检测，但是如何实时检测间充质干细胞衰老仍然是亟待解决的问题。crispr基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成dna双链缺口(double-strandbreaks,dsbs)，通过细胞内非同源末端链接(non-homologousendjoining,nhej)实现对原位基因的敲除，通过同源重组(homologydirectedrepair,hdr)在外源基因模板存在的情况下，实现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献cn105985985a中所述，利用crispr/cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的mscs中的免疫抗原b2m、炎症因子tnf-α进行敲除，从而实现降低异体间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，nhej修复基因占主导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大，整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在mscs中进行大片段基因敲入的报道。技术实现要素：本公开的目的是实现对间充质干细胞衰老的实时检测，提供可实时检测间充质干细胞衰老的细胞模型以进行药物筛选和毒性检测。为了实现上述目的，本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞衰老的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：s1、将针对衰老相关基因的敲入位点的sgrna和cas9蛋白混合以形成rnp复合物；所述衰老相关基因包括klotho、p16、p21、p53、gata4、sirt1、sirt3、sirt6和morf4中的至少一种；所述衰老相关基因的敲入位点为所述衰老相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；s2、将插入有模板dna同源重组载体包装到aav病毒中，形成待转染aav病毒颗粒；所述模板dna包括针对所述衰老相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2a肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由衰老相关基因、2a肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；s3、将间充质干细胞的悬液与所述rnp复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；s4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的aav病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；s5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过pcr及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明建立了一种可在间充质干细胞高效敲入长片段报告基因的方法，在不影响衰老相关基因表达的情况下，原位插入报告基因，由此可以构造多种与间充质干细胞衰老相关的细胞模型，并且进而可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞是否存在老化现象，并可在动物模型中检测制备的间充质干细胞药物移植至体内不同组织，处于疾病或衰老的组织微环境中，组织特异性的细胞因子及有害代谢产物是否会影响间充质干细胞在体内的衰老而影响细胞体内存活时间与功能，便于对间充质干细胞体内作用时间与有效性进行深入研究，促进其临床转化及工业化生产制备中的质量监测。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞衰老的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：s1、将针对衰老相关基因的敲入位点的sgrna和cas9蛋白混合以形成rnp复合物；所述衰老相关基因包括klotho、p16、p21、p53、gata4、sirt1、sirt3、sirt6和morf4中的至少一种；所述衰老相关基因的敲入位点为所述衰老相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；s2、将插入有模板dna同源重组载体包装到aav病毒中，形成待转染aav病毒颗粒；所述模板dna包括针对所述衰老相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2a肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由衰老相关基因、2a肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；s3、将间充质干细胞的悬液与所述rnp复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；s4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的aav病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；s5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过pcr及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。本发明通过rnp复合物以电转的方式将sgrna和cas9蛋白转入细胞中，并在电转后的合适的时间内选择aav病毒将插入有荧光蛋白报告基因的同源重组载体转染入细胞中，最终使得sgrna、cas9蛋白和插入有待整合的模板dna的载体共同通过crispr基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向敲入靶点位置。其中，所述衰老基因是以ncbi数据库中的genesymbol来定义的，具体信息如表1所示，其对应的代表性sgrna序列和左右同源臂序列也列于表1中。优选地，所述sgrna如seqidno.1、4、7、10、13、16、19、22或25所示；相应地，所述左同源臂序列如seqidno.2、5、8、11、14、17、20、23或26所示；相应地，所述右同源臂序列如seqidno.3、6、9、12、15、18、21、24或27所示.表1其中，可选地，所述sgrna带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对衰老相关基因的敲入位点的sgrna和cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在线sgrna设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据衰老相关基因的敲入位点设计sgrna的序列并加以合成。其中，sgrna序列的5’端和3’端末尾的可以分别添加有甲基(-o-me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。其中，可选地，将针对衰老相关基因的敲入位点的sgrna和cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。其中，可选地，步骤s3中，所述间充质干细胞的悬液与所述rnp复合物混合时，相对于每106个所述间充质干细胞，以sgrna的量计，所述rnp复合物的用量为1-50μmol；所述间充质干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×107个/ml；以sgrna的量计，所述rnp复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μl。其中，可选地，步骤s3中，电转的条件包括：电场强度为50-250v/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。其中，可选地，步骤s4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的aav病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。其中，可选地，步骤s4中，待转染的aav病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的aav病毒颗粒的moi值为104-106。moi值是感染时病毒与细胞数量的比值。其中，优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞。所述aav病毒的血清型为aav-6病毒、aav-1病毒或aav9病毒，优选所述aav病毒的血清型为aav9病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因敲入干细胞的效率。其中，所述自剪切2a肽用于将衰老相关基因的蛋白和荧光蛋白切割开，其可以为t2a肽、f2a肽和p2a肽中的至少一种；所述荧光蛋白报告基因的选择可以较宽，例如可以为egfp、ecfp、eyfp、erfp、mcherry、tdtomato、venus中的至少一种。其中，可选地，所述荧光蛋白报告基因的序列如seqidno.30所示；所述载体的骨架序列如seqidno.31所示。所述载体的骨架序列是指未插入模板dna的载体的序列。以下通过实施例进一步详细说明本发明：实施例1构建在间充质干细胞klotho基因中插入egfp报告基因的细胞模型。采用klotho基因原位基因启动子，在终止密码子前插入t2a-egfp。1、sgrna设计以及合成(1)通过在线sgrna设计工具(http://crispr.mit.edu/)针对人源klotho基因的tag终止子上游100bp以内的序列设计靶向识别的sgrna。优选结果如下：5’-ucacacccgaaagucuuuacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’(seqidno.1)。其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrrna。(2)该sgrna由integrateddnatechnologies公司合成并在该sgrna序列的5’端和3’端末尾分别添加o-me、phosphorothioate的修饰。2、体外法检测sgrna的活性(1)从基因组扩增识别靶序列片段(2786bp)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。klotho-fw:5’-cataaagatttaaccttgctg-3’(seqidno.28)，klotho-rev:5’-gtatgtcattaaccagatacat-3’(seqidno.29)。(2)将pcr扩增产物200ng，sgrna100ng，spcas9200ng(购于sigma-aldrich，货号：tgen-cp-500ug)，10×缓冲液2μl配置成20μl反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。(3)使用tae配置1％的biowest琼脂糖胶，在90v的电压下电泳30min，使用凝胶成像仪观察结果。3、aav包装系统选择及质粒构建(1)待编辑细胞为人骨髓间充质干细胞，根据aav组织亲和性对照表，优选血清型为aav-9的包装系统。(2)aav-9的总包装容量为4.7kb。在aav包装系统的装载载体上所插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp左右)。左同源臂序列为seqidno.2，其中，第412-414位碱基为经过突变的pam位点。右同源臂序列为seqidno.3。插入片段为t2a和egfp，共777bp，序列如seqidno.30所示。使用无缝克隆(nebuilder高保真dna组装试剂盒，购于neb(北京)有限公司，货号：e2621s)的方法将cassette插入到paav载体上，载体序列为seqidno.31。为了避免spcas9/sgrnarnp复合物对重组位点的二次切割从而影响基因编辑的效率，通过primerstar高保真dna聚合酶(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：r044a)利用pcr刻环的方法在pam位点引入了点突变(tgg突变为tcg)，从而避免了spcas9/sgrnarnp复合物对识别位点的切割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。klotho-pam-mut-fw:5’-acccgaaagtctttactcgctttcatagcttttct-3’(seqidno.32)。klotho-pam-mut-rev:5’-agaaaagctatgaaagcgagtaaagactttcgggt(seqidno.33)。4、aav病毒包装及纯化(1)在病毒包装前一天将hek293t细胞按照每皿5×106的数量种植到直径10cm的含有10ml完全培养基(dmem(购于thermofisherscientific,inc.，货号：c11995500bt)+10％fbs(购于thermofisherscientific,inc.，货号：sv30087.02)+1％ps双抗购于thermofisherscientific,inc.，货号：sv30010)的corning培养皿中，共种植30皿。在37度、5％co2的细胞培养箱中培养24小时。(2)病毒包装当天检查hek293t细胞汇合度是否达到80％。每皿按照以下步骤单独配置转染体系：将10μg的paav-cassette，10μg的phelper，10μg的paav9-rc混合后使用无血清的dmem调整体积到910μl后经漩涡振荡器混匀，加入90μl的pei(购于polysciencesasiapacific,inc.货号：23966-2)后再次使用漩涡振荡器混匀，静置15分钟。将corning培养皿中的完全培养基替换成9ml无血清培养基，再将之前经过静置的dna-pei复合物均匀滴加到培养皿中，轻柔晃匀后置于37度、5％co2的细胞培养箱中培养6小时。转染6h后将corning培养皿中的无血清培养基替换成完全培养基，于37度、5％co2的细胞培养箱中继续培养。(3)在转染60小时之后，分别收获上清和细胞。将收集得到的上清经4000rpm4度离心10分钟后弃去杂质。将去除杂质的上清加入amiconultra-15超离柱中(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：ufc905096)，经过若干次4000rpm、4度离心30分钟将体积浓缩至10到15ml。将用细胞刮刀刮下的hek293t细胞用适量培养基吹匀并转移至50ml离心管中，经1500rpm、4度离心10min后弃上清，所有沉淀总共加3ml细胞裂解缓冲液(150mmnacl,20mmtrisph8.0)使其重悬。将重悬细胞在-80℃酒精浴和37℃水浴中反复冻融三次。将浓缩的上清和冻融的细胞悬液混匀，添加1mmgcl2至终浓度为1mm。添加benzonase(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：70746-1ku)至终浓度为25u/ml，混匀后37℃反应40min。取出50ml离心管，4℃，4000rpm离心20min，取上清。(4)采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒。配置碘克沙醇(购于sigma-aldrich，货号：d1556-250ml)梯度17％：5ml10×pbs,0.05ml1mmgcl2,0.125ml1mkcl,10ml5mnacl,12.5mloptiprep，加水补足到50ml。25％：5ml10×pbs,0.05ml1mmgcl2,0.125ml1mkcl,20mloptiprep,0.1ml0.5％phenolred，加水补足到50ml。40％：5ml10×pbs,0.05ml1mmgcl2,0.125ml1mkcl,33.3mloptiprep，加水补足到50ml。60％：0.05ml1mmgcl2,0.125ml1mkcl,50mloptiprep,0.025ml0.5％phenolred。向超速离心管中由下至上依次缓慢加入3.5ml60％、3.5ml40％、4ml25％、4ml17％的碘克沙醇。将浓缩的上清和细胞裂解液缓慢加在离心管最上层，用细胞裂解缓冲液补满离心管。使用贝克曼l-80xp落地超速离心机、70ti定角转子，加速6，减速9，60000rpm4度离心2小时。用平头注射器吸取40％浓度层碘克沙醇，转移至amiconultra-15超离柱中，加入10mlpbs4000rpm4℃离心20分钟，重复3次。将病毒离心浓缩至1ml。(5)利用qpcr对aav9进行滴度检测。根据egfp序列设计引物，使qpcr产物的长度约200bp。qpcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。aavgfpf:5’-tcagcttcaggcaccaccac-3’(seqidno.34)。aavgfpr:5’-tgaacttgtggccgtttacgtcg-3’(seqidno.35)。制备7个aav9重组质粒标准品，以1：10的比例进行梯度稀释。从10ng/μl以下的浓度开始稀释，分别为10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μl和0.00001ng/μl。根据以下公式计算稀释的dna拷贝数：使用dnasei(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：2270a)对病毒样本进行预处理。使用2×sybrpcrmix(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：qps-201)配置qpcr反应体系。使用roche480ii实时荧光定量pcr系统进行定量pcr。根据ct值，绘制标准曲线，并计算aav9的滴度。5、rnp复合物组装及待编辑细胞的预处理(1)将spcas9(终浓度300ug/ml)和klothosgrna(终浓度175ug/ml)按照1:3的摩尔比进行混合在室温孵育10min，从而形成spcas9/sgrnarnp复合物。(2)观察骨髓间充质干细胞汇合率达到80％后移除含10％fbs的dmem/f12培养基(购于thermofisherscientific,inc.，货号：11320082)，用pbs漂洗一次。加入0.05％胰酶(购于thermofisherscientific,inc.，货号：25200-072)使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。即刻加入新鲜的dmem/f12完全培养基，用1ml枪扇形吹打培养皿底，使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。使用opti-mem(购于thermofisherscientific,inc.，货号：11058021)调整细胞密度到5×107/ml。(3)将10μl经过室温孵育的spcas9/sgrnasnp复合物(以sgrna的量计，所述rnp复合物的含量为7.5μmol)和10μl经过计数并使用opti-mem重悬的骨髓间充质干细胞悬液(其中细胞数量为5×105个)相混合，将20μl混合液转移到16孔电转板条中。使用lonza4d核转染系统选择cb150模式(电场强度为150v/cm，单次脉冲时间为10ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为20s，总脉冲次数为5次)进行电转。电转完成后立刻将细胞转移到含dmem/f12完全培养基的24孔板中于37度、5％co2的细胞培养箱中继续培养。(4)电转完第5到20分钟内开始按照1×105的moi值轻柔得滴加aav9，并于电转完20分钟内滴加完毕。(5)电转完24小时后将旧培养基移除，更换为dmem/f12完全培养基。6、单克隆细胞株的培养：(1)电转完第48小时使用pbs漂洗一次培养皿。加入胰酶使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。即刻加入新鲜的dmem/f12完全培养基，用1ml枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，保证细胞间没有粘连，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。按每个10cm培养皿15000个细胞的比例把细胞种植到含dmem/f12完全培养基的10cmcorning培养皿中于37度、5％co2的细胞培养箱中继续培养。(2)每24小时进行观察并移除旧的培养基，更换为新的dmem/f12完全培养基。72小时后可以在镜下观察到克隆的形成。(3)电转后12到14天在十倍的物镜下可以看到克隆的大小已经相当于一个硬币。不能让克隆继续变大或者相交。在96孔板上的每个孔中加入120μldmem/f12完全培养基，标记板o。在超净台中通过显微镜进行观察，将p200移液器调节至45μl使用带有滤芯的枪头刮碎克隆，用移液器收集细胞并转移到96孔板的小孔中。(4)克隆挑取之后每24小时后将旧的培养基移除，更换为新的dmem/f12完全培养基，四天后细胞汇合率达到80％。(5)在两块96孔板上的每个孔中加入133μldmem/f12完全培养基，分别标记为板a、板b。将板o的每孔使用150μl的pbs漂洗。每孔中加入35μl的胰酶，消化5到10分钟后每孔中添加165μl的dmem/f12完全培养基。从孔中分别移取66μl的细胞悬液转移到板a和板b的对应小孔中。板a用于基因组提取，板b备用。在板o的每个孔中直接添加165μl的细胞冻存液后至于深低温冰箱存储。实施例2构建在骨髓间充质干细胞周期调控基因p16基因中插入egfp报告基因的细胞模型。采用p16基因原位基因启动子，在终止密码子前插入2a-egfp。通过在线sgrna设计工具(http://crispr.mit.edu/)在p16基因第2个外显子靠近终止密码子(tga)上游100bp以内的序列设计靶向识别的sgrna。p16sgrna：5’-gggccgucugcccguggaccguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’。(seqidno.4)。其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrrna。该sgrna委托integrateddnatechnologies公司合成，并对临近该sgrna的5’和3’末端分别进行o-methyl及-phosphorothioate修饰。2、体外法检测sgrna的活性(1)从基因组扩增识别靶序列片段(1084bp)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。p16-fw:5’-tgaagttcaacattcccagaagc-3’，(seqidno.36)，p16-rev:5’-agggtcagcgaagtcttggt-3’，(seqidno.37)。(2)将pcr扩增产物200ng，sgrna100ng，spcas9200ng(购于sigma-aldrich，货号：tgen-cp-500ug)，10×缓冲液2ul配置成20ul反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。(3)使用tae配置1％的biowest琼脂糖胶，在90v的电压下电泳30min，使用凝胶成像仪观察结果。3、aav包装系统选择及质粒构建(1)待编辑细胞为脂肪间充质(adsc)干细胞株，根据aav组织亲和性对照表，优选血清型为aav9的包装系统。(2)aav9的总包装容量为4.7kb。在aav包装系统的装载载体上所插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp左右)。左同源臂序列为seqidno.5，其中第489-494位碱基为经过突变的位于pam位点上游的第2,3个密码子，因为pam位点无法通过同义突变而失效，右同源臂序列为seqidno.6。插入片段为t2a和egfp，共777bp，序列如seqidno.30所示。使用无缝克隆(nebuilder高保真dna组装试剂盒，购于neb(北京)有限公司，货号：e2621s)的方法将cassette插入到paav载体上，载体序列为seqidno.31。为了避免spcas9/sgrnarnp复合物对重组位点的二次切割从而影响基因编辑的效率，通过primerstar高保真dna聚合酶(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：r044a)利用pcr刻环的方法在位于pam位点‘上游的第2、3个密码子引入点突变(cgt变为cgc，gga变为ggc)，从而避免了spcas9/sgrnarnp复合物对识别位点的切割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。p16-pam-mut-fw:5’-cgcgatgcctggggccgtctgcccgcggccctggc-3’(seqidno.38)。p16-pam-mut-rev:5’-gccagggccgcgggcagacggccccaggcatcgcg-3’(seqidno.39)。4、aav病毒包装及纯化同实施例15、rnp复合物组装及待编辑细胞的预处理同实施例16、lonza4d系统电转及aav感染同实施例17、单克隆细胞株的培养同实施例1对比例1按照实施例1的方法进行，不同的是电转完第35min开始按照1×105的moi轻柔得滴加aav9，并于电转完50分钟内滴加完毕。测试实施例11、荧光检测等位基因插入效率检测检测样品：实施例1、2以及对比例1经过电转和aav感染后第四天经过胰酶消化后加入新鲜的dmem/f12完全培养基使其重悬制成的干细胞悬液。检测方法：因为在目标基因座上插入的t2a-egfp序列表达绿色荧光蛋白，使用流式细胞仪检测并统计能发出绿色荧光的细胞数量以及细胞总量。将能发出绿色荧光的细胞数量除以细胞总量可以的到总的编辑效率。实验结果：实施例1编辑效率为73％，实施例2编辑效率为76％，对比例1编辑效率为8％。2、pcr检测等位基因插入效率检测样品：96孔板培养的单克隆细胞株(a板和b板)检测方法：在同源臂外设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实施例1、对比例1使用klotho-fw、klotho-rev。实施例2使用p16-fw、p16-rev。将96孔板中的克隆所获得的基因组进行pcr扩增。将pcr产物进行电泳并分析。实施例1、对比例1只有2786bp左右条带的为非编辑细胞，只有3563bp的为双等位基因编辑细胞，既有2786bp左右条带也有3563bp的为单等位基因编辑细胞。实施例2中只有1413bp左右条带的为非编辑细胞，只有2190bp的为双等位基因编辑细胞，既有1413bp左右条带也有2190bp的为单等位基因编辑细胞。实验结果：实施例1编辑效率：等位基因双编辑62％、等位基因单编辑77％，对比例1编辑效率：等位基因双编辑1％、等位基因单编辑7％；实施例2编辑效率：等位基因双编辑58％、等位基因单编辑76％；可见电转与病毒转染的时间间隔对基因敲入的效率影响较大，在优选在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的aav病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染的情况下，基因敲入的效率最高。3、所构建细胞模型在体外压力下连续传代所致的细胞衰老检测将实施例1得到的进行了egfp敲入的骨髓间充质干细胞的骨髓间充质干细胞分别铺种于6孔板，贴壁后，分别加入终浓度为100μm的dna损伤诱导剂4-硝基喹啉-n-氧化物(购于sigma-aldrich，货号：n8141)以及终浓度为6μg/ml的内质网应激诱导剂——衣霉素(购于sigma-aldrich，货号：654380-10mg)，总体积为2ml，处理两组。依次收集处理0h、12h、24h、48h、72h的细胞后，一组用流式细胞仪检测样本egfp的发光情况，统计发光细胞所占百分比；另一组用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(购于北京索莱宝科技有限公司，货号：g1580)进行染色，然后在光学显微镜下观察x-gal的显色情况，统计显色细胞所占百分比。结果如表2(4-硝基喹啉-n-氧化物)，表3(衣霉素)所示。表2dna损伤压力下细胞衰老状态检测(实施例1)0h12h24h48h72hegfp(荧光表达细胞比率)97％85％73％54％16％x-gal(阳性细胞比率)0％12％30％69％97％表3内质网损伤压力下细胞衰老状态检测(实施例1)0h12h24h48h72hegfp(荧光表达细胞比率)96％89％75％60％32％x-gal(阳性细胞比率)0％7％26％51％83％上述表2和表3结果显示，实施例1中所建立的模型可在不致细胞死亡的情况下，实时检测不同压力下的细胞衰老，klotho基因下调与细胞衰老相关，egfp荧光表达细胞比率下降代表衰老细胞数量增多。与x-gal染色法相比，具有一致的细胞衰老趋势。实施例2操作同实施例1，用4-硝基喹啉-n-氧化物或衣霉素处理后的细胞发光或显色百分比如表4、5所示。表4dna损伤压力下细胞衰老状态检测(实施例2)0h12h24h48h72hegfp(荧光表达细胞比率)0％9％26％67％94％x-gal(阳性细胞比率)0％14％31％71％97％表5内质网损伤压力下细胞衰老状态检测(实施例2)0h12h24h48h72hegfp(荧光表达细胞比率)0％13％23％68％89％x-gal(阳性细胞比率)0％11％28％70％90％上述表4和表5结果显示，实施例2中所建立的模型可在不致细胞死亡的情况下，实时检测不同压力下的细胞衰老，p16基因上调与细胞衰老相关，egfp荧光表达细胞比率上升代表衰老细胞数量增多。与x-gal染色法相比，具有一致的细胞衰老趋势。4、所构建细胞模型在正常情况下连续传代所致的细胞衰老检测将实施例1得到的进行了egfp敲入的骨髓间充质干细胞的骨髓间充质干细胞铺种于10cmdish中正常传代，依次将0代，2代，5代，10代，15代细胞铺种于96孔中，利用celltiter试剂盒(购于promega，货号：g3582)检测，统计对应代数细胞的倍增活力以此表征细胞的衰老情况。同时取相应代数的细胞用流式细胞仪检测egfp的发光情况，统计发光细胞所占的百分比。结果如表6所示。表6连续传代下细胞衰老检测(实施例1)0代2代5代10代15代celltiter(细胞倍增速率)100％96％60％25％11％egfp(荧光表达细胞比率)99％98％87％75％32％结果表明：在正常连续传代压力下，实施例1构建的细胞检测模型中egfp荧光表达细胞比率的下降伴随着细胞活力下降，由此可以实时检测间充质干细胞衰老。实施例2操作同实施例1，结果如表7。表7连续传代下细胞衰老检测(实施例2)0代2代5代10代15代celltiter(细胞倍增速率)100％95％73％21％9％egfp(荧光表达细胞比率)1％15％23％47％89％结果表明：在正常连续传代压力下，实施例2构建的细胞检测模型中egfp荧光表达细胞比率的上升伴随着细胞活力下降，由此可以实时检测间充质干细胞衰老。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。序列表<110>杭州观梓健康科技有限公司<120>一种制备可实时检测间充质干细胞衰老的细胞模型的方法<130>10968-k-hzgz<160>39<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>103<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ucacacccgaaagucuuuacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu103<210>2<211>500<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggagaatctgttgaacctgggaggcggaggttgcagtgagtcaagatggtgccattgcac60tccagcctgtgtgacagagcaagactccgtctcaaaaaaaaaaaaaagtgatgtgttgtg120tgcaaaatacgtaataactactctcctatccttttgtttttccagcccacatactggatg180gtatcaatctttgcggatactttgcttattcgtttaacgaccgcacagctccgaggtttg240gcctctatcgttatgctgcagatcagtttgagcccaaggcatccatgaaacattacagga300aaattattgacagcaatggtttcccgggcccagaaactctggaaagattttgtccagaag360aattcaccgtgtgtactgagtgcagtttttttcacacccgaaagtctttactcgctttca420tagcttttctattttttgcttctattatttctctctcccttatattttactactcgaaga480aaggcagaagaagttacaaa500<210>3<211>503<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tagtagttctgaacatttttctattcattcattttgaaataattatgcagacacatcagc60tgttaaccatttgcacctctaagtgttgtgaaactgtaaatttcatacatttgacttcta120gaaaacatttttgtggcttatgacagaggttttgaaatgggcataggtgatcgtaaaata180ttgaataatgcgaatagtgcctgaatttgttctctttttgggtgattaaaaaactgacag240gcactataatttctgtaacacactaacaaaagcatgaaaaataggaaccacaccaatgca300acatttgtgcagaaatttgaatgacaagattaggaatattttcttctgcacccacttcta360aatttaatgtttttctggaagtagtaattgcaagagttcgaatagaaagttatgtaccaa420gtaaccatttctcagctgccataataatgcctagtggcttcccctctgtcaaatctagtt480tcctatggaaaagaagatggcag503<210>4<211>103<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gggccgucugcccguggaccguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu103<210>5<211>500<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cctggagtaaaagtcagtctgtccctgcccctttgctattttgcccgtgcctcacagtgc60tctctgcctgtgacgacagctccgcagaagttcggaggatataatggaattcattgtgta120ctgaagaatggatagagaactcaagaaggaaattggaaactggaagcaaatgtaggggta180attagacacctggggcttgtgtgggggtctgcttggcggtgagggggctctacacaagct240tcctttccgtcatgccggcccccaccctggctctgaccattctgttctctctggcaggtc300atgatgatgggcagcgcccgagtggcggagctgctgctgctccacggcgcggagcccaac360tgcgccgaccccgccactctcacccgacccgtgcacgacgctgcccgggagggctt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