一种兰花基因转化方法与流程

本发明涉及生物工程领域中进行基因转化的方法，特别涉及一种兰花基因转化方法。
背景技术：
：兰科植物(俗称兰花)是单子叶植物第一大科，有801属近3000种。多数兰花种类具有很高的观赏和药用价值，因此兰花在花卉产业中占有举足轻重的地位。目前全球兰花年销售额已超70亿美元，成为重要的新型产业。而追求新奇特是花卉产业最大的特色，也是推动产业发展的重要因素。然而多数兰花品种生长缓慢，种子成熟所需时间较长，采用传统杂交育种方法周期长，且子代性状难以预期，需要投入较高成本。与传统育种方法相比，转基因技术优势明显：(1)能突破远缘杂交瓶颈，实现物种间基因的交流，为兰花品种改良提供了新的可能；(2)能定向改变生物性状，育种更具预测性；(3)缩短育种时间。随着现代分子生物学技术迅速发展，近几年兰花转基因研究进展很快，主要在蝴蝶兰、石斛兰、蕙兰、文心兰等兰花中建立了遗传转化方法包括基因枪法、农杆菌转化法、花粉管通道法、子房注射法等。其中，农杆菌介导法具有可行性强，操作简单，成本低，重复性好等特点，但还存在转化周期过长，转化效率低等不足，目前报道的兰花转基因方法从遗传转化到获得转基因成苗需要仍2-3年时间。因此，缺乏高效快速的兰花遗传转化体系仍然是兰花分子生物学研究基因功能，以及分子育种的关键制约因素。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效，快速，简便的使用农杆菌介导的兰花基因转化方法，可用于体内验证兰花基因功能，以及目标性状的定向改良。本发明的兰花基因转化方法，包括以下步骤：(1)原球茎诱导：以兰花的芽或茎作为外植体进行原球茎诱导，直至原球茎长至直径0.2～0.5cm；(2)共培养：将步骤(1)得到的原球茎进行预培养，然后浸泡于od600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，侵染完成后将原球茎转移至共培养基中避光培养，所述的共培养基每升含有花宝一号3g、6-ba2.0mg、naa0.2mg、as200μmol，余量为水；(3)原球茎筛选：将步骤(2)共培养后的原球茎洗涤脱菌，去除多余农杆菌后，转移至增殖培养基上进行培养，得到抗性原球茎；所述的增殖培养基每升含有花宝一号3g、6-ba3.0mg、naa0.3mg、潮霉素5mg，头孢霉素500mg，余量为水；(4)将步骤(3)得到的抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，直至得到5～6cm高的小苗，然后进行炼苗移栽，所述的芽诱导培养基每升含有花宝一号3g、naa0.5mg、潮霉素5mg，头孢霉素500mg，余量为水。优选，所述的以兰花的芽或茎为外植体进行原球茎诱导具体为：将兰花的芽或茎接种于培养基中，避光培养，直至在芽切口处或茎节处可以看到浅绿色的小原球茎，然后转移到正常光周期条件下培养，直至原球茎的直径长至0.2～0.5cm，所述的培养基每升含有花宝一号5g、naa0.2mg、6-ba0.2mg，余量为水。优选，所述步骤(2)的预培养的时间为1天，预培养的条件为：光强20-40μmo1·m-2·s-1，光周期16h/d，环境温度为24±1℃，相对湿度50～60％，在步骤(1)得到的原球茎上划一道伤口，再接种于预培养培养基，光下培养1天，所述的预培养基每升含有花宝一号3g、naa0.2mg、6-ba2mg，余量为水。优选，所述步骤(2)将原球茎转移至共培养基中避光培养，其条件为：在23～25℃培养2天。优选，所述的将步骤(2)共培养后的原球茎洗涤除菌是将原球茎依次用含0.05％m/v吐温的灭菌水清洗一次，用无菌水清洗三次，用含500mg/l头孢霉素的无菌水清洗三次，并在最后一次清洗过程中漩涡震荡30分钟，去除多余农杆菌。优选，所述步骤(3)的转移至增殖培养基上进行培养，其培养条件为：在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养2个月。优选，所述步骤(4)的抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，其培养条件为：在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养3个月。优选，所述的浸泡于od600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，其侵染时间为20～30min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明提供的兰花基因转化方法在农杆菌侵染后利用原球茎直接诱导产生新的原球茎，随后诱导出芽到成苗移栽，整个过程加入抗生素筛选，获得了高阳性率的转基因株系，同时省略了再生和壮苗生根过程，最大程度节省了转化周期和成分，具有操作简便、转化周期短、转化效率高、成本较低的优点，尤其适合兰花体内基因功能验证。(2)本发明解决竹叶兰基因遗传转化问题，最直接的为获得抗病/抗逆/提前开花，改变花色/花型和叶色的竹叶兰以及其他兰科植物奠定基础。附图说明图1为不同预培养时间对转化效率的影响。图2为不同乙酰丁香酮(as)浓度对转化效率的影响。图3为不同农杆菌浓度对转化效率的影响。图4为不同侵染时间对转化效率的影响。图5为不同共培养时间对转化效率的影响。图6为pcr检测抗性苗结果。其中，line1-8为：抗性植株，wt为未经转化植株。图7为竹叶兰遗传转化及抗性植株的再生。a，播种；b，萌发原球茎；c，0.5cm大小切块原球茎；d，农杆菌菌液；e，共培养原球茎；f，筛选抗性芽；g，抗性芽gfp检测；h，与g相同；i，抗性苗生长。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1竹叶兰增殖快繁体系的建立(1)兰花外植体选择组织培养实验中，外植体的选择十分重要，不同的植物选择的外植体也不相同。实验结果表明，以竹叶兰的叶片或根为外植体，根或叶片容易褐化，不能诱导出原球茎，而茎、芽在适宜的培养基中均可成功诱导出原球茎，且芽的诱导效果好(表1)。将芽或茎段接种于培养基中，暗处理30天后，在芽切口处和茎节处可以看到浅绿色小原球茎。然后转移到正常光周期条件下培养30天后，原球茎变绿，且体积变大。由茎诱导出的原球茎比芽诱导出的体积大，约0.3～0.5cm，但诱导率低；添加植物激素能显著提高原球茎的诱导率。当激素浓度组合为naa0.2mg/l+6-ba0.2mg/l(b6)(即每升培养基含有花宝一号3g、naa0.2mg、6ba0.2mg，余量为水)时，芽的诱导率最高，达到56％，而茎的诱导率仅为10％(表1)。因此，芽诱导原球茎的效果最好，是一种较好的原球茎诱导材料。表1激素对芽、茎诱导原球茎的影响(2)不同植物激素对原球茎增殖的影响在探究兰花遗传转化时，需要大量的原球茎受体材料，因此在建立再生体系过程中，原球茎增殖是关键的一步。将竹叶兰的原球茎切成0.5cm大小并接种到含不同激素浓度的培养基中，通过观察1个月后的增殖情况，如表2所示，不同的naa、6-ba浓度对原球茎增殖有显著影响。当naa浓度在0.2～0.4mg/l之间时，原球茎增殖倍数随着naa浓度的升高而增加；当naa为0.4mg/l时，增殖倍数高达15.21，而当naa为0.5mg/l时，增殖倍数降低。同时，原球茎生长情况随6-ba浓度的改变而改变，当6-ba浓度在2～4mg/l之间时，原球茎随6-ba浓度的增加而生长健壮；但当6-ba为5mg/l时，原球茎增殖系数下降且颜色变黄绿长势较弱。综上所述，当激素浓度组合为naa0.3mg/l+6-ba3mg/l(c6)(即每升培养基含有花宝一号3g、naa0.3mg、6-ba3mg，余量为水)时，竹叶兰原球茎增殖系数为13.37，原球茎呈深绿色，生长强壮，为最佳的原球茎增殖激素浓度。表2激素对原球茎增殖的影响激素组合naa(mg/l)6-ba(mg/l)接种数增殖倍数生长情况c10.221005.63±0.23efg一般、深绿c20.231006.02±0.63de强壮、深绿c30.241005.91±0.37def强壮、浓绿c40.251006.31±0.75de一般、黄绿c50.321009.64±0.34b一般、深绿c60.3310013.37±0.98a强壮、深绿c70.341009.01±0.56b强壮、浓绿c80.351008.34±0.45bc一般、黄绿c90.421009.12±0.67b一般、深绿c100.4310015.21±1.27a一般、深绿c110.441009.64±0.63b强壮、深绿c120.451007.12±0.32cd一般、黄绿c130.521005.31±0.74efg一般、深绿c140.531005.64±0.28efg强壮、深绿c150.541004.65±0.47fg一般、深绿c160.551004.53±0.23g一般、黄绿实施例2竹叶兰转化效率的影响因素(1)不同预培养时间对转化效率的影响预培养使受体材料处于细胞分裂状态，更容易整合外源基因，提高遗传转化效率。受体预培养时间与转化效率有很大关系，每个受体都有最适的预培养时间，预培养时间太长，切割伤口愈合而降低转化效率。本发明将竹叶兰的原球茎切成0.5cm大小后进行预培养1-3天，培养条件为光强40μmo1·m-2·s-1，光周期16h/d，环境温度为24±1℃，相对湿度50～60％，预培养基每升含有花宝一号3g、naa0.2mg、6-ba2mg，余量为水。然后浸泡于od600＝0.5的农杆菌菌液中侵染30min，再转移至添加了200μmol/las的共培养基(每升含有花宝一号3g、6-ba2.0mg、naa0.2mg、as200μmol，余量为水)中培养，2天后经洗涤脱菌转入至含500mg/l头孢霉素和5mg/l潮霉素的增殖培养基(每升含有花宝一号3g、6-ba3.0mg、naa0.3mg、潮霉素5mg和头孢霉素500mg，余量为水)中进行抗性苗筛选，观察并统计转化2周后的竹叶兰抗性芽生长情况。结果显示，竹叶兰原球茎的预培养时间为1天，转化效果最好(图1)。(2)不同as浓度对转化效率的影响农杆菌和原球茎伤口接触时(即侵染阶段和共培养阶段)t-dna完成转移整合，此过程中添加乙酰丁香酮(as)能大幅度提高转化效率。本实验以0.5cm的竹叶兰原球茎为材料，预培养1天后浸泡于od600＝0.5的农杆菌菌液中侵染30min，转移至添加了0.1mm～0.5mmas的共培养基(每升含有花宝一号3g、6-ba2.0mg、naa0.2mg、as100～500μmol，余量为水)中培养，2天后经洗涤脱菌转移至含500mg/l头孢霉素和5mg/l潮霉素的增殖培养基(每升含有花宝一号3g、6-ba3.0mg、naa0.3mg、潮霉素5mg和头孢霉素500mg，余量为水)中进行抗性苗筛选，观察并统计转化2周后的竹叶兰抗性芽生长情况。结果显示，当as＝0.1mm时，部分原球茎长出抗性芽，当as＝0.2mm时，大多数原球茎出现抗性芽且呈绿色；当as浓度超过0.2mm后，原球茎抗性芽减少，可能是as浓度过高对原球茎生长有影响。因此，适宜遗传转化的as浓度为0.2mm(图2)。(3)不同农杆菌浓度对转化效率的影响农杆菌侵染时，od600值过低会造成原球茎未被侵染，转化失败，od600值过高时，原球茎会受菌液毒害而褐化死亡。本发明使用od600值为0.2～0.8的农杆菌菌液侵染竹叶兰原球茎，转化材料为0.5cm的竹叶兰原球茎切块，预培养1天后浸泡于od600＝0.2～0.8的农杆菌菌液中侵染30min，转移至添加了0.2mmas的共培养基(每升含有花宝一号3g、6-ba2.0mg、naa0.2mg、as200μmol，余量为水)中培养，2天后经洗涤脱菌转入至含500mg/l头孢霉素和5mg/l潮霉素的增殖培养基(每升含有花宝一号3g、6-ba3.0mg、naa0.3mg、潮霉素5mg和头孢霉素500mg，余量为水)中进行抗性苗筛选，观察并统计转化2周后的竹叶兰抗性芽生长情况。结果显示，当od600值为0.2时，少数原球茎出现抗性芽且呈绿色；当od600值为0.4～0.6时，大多原球茎长出抗性芽且生长良好；当od600值超过0.6时，原球茎出现抗性芽但有褐化死亡现象，且后期农杆菌难以抑制。因此，最适竹叶兰转化的农杆菌液od600值为0.4～0.6(图3)。(4)不同侵染时间对转化效率的影响农杆菌先粘附在原球茎伤口处，经反应感染后整合进细胞基因组，完成转化。控制侵染时间可减少后续实验中农杆菌的污染，时间太短农杆菌未接触伤口，转化失败，时间太长受体因农杆菌毒害缺氧而死亡。本发明使用处于对数生长期的农杆菌液侵染竹叶兰原球茎10～40分钟。结果显示，农杆菌侵染原球茎10分钟，部分原球茎长出抗性芽；农杆菌浸泡原球茎20分钟，大多数原球茎呈绿色且出现抗性芽；农杆菌侵染原球茎超过30分钟，原球茎有抗性芽，少数呈黄绿色甚至变白。由此可知，最适侵染时间为20分钟，转化效率高且原球茎生长健壮，最适转化(图4)。(5)不同共培养时间对转化效率的影响在共培养过程中，原球茎伤口处细胞的生长和农杆菌的繁殖共同进行，有效提高转化效率，但时间过长，农杆菌在受体表面大量生长，会使受体细胞因缺少营养而活性降低，甚至死亡，并造成后期脱菌困难。本发明将侵染后原球茎共培养1～3天后发现，共培养1天时，少量原球茎长出抗性芽，说明大多原球茎没有完成转化；共培养2天时，大多原球茎出现抗性芽，转化率大大提高；共培养3天时，原球茎出现抗性芽，但部分原球茎因农杆菌毒害而褐化死亡，转化效率下降(图5)。因此，共培养以2天为宜，转化效率高，竹叶兰生长良好。本实施例的洗涤脱菌是将原球茎依次用含0.05％m/v吐温的灭菌水清洗一次，用无菌水清洗三次，用含500mg/l头孢霉素的无菌水清洗三次，并在最后一次清洗过程中漩涡震荡30分钟，去除多余农杆菌。本实施例中各培养基的配制方法是把上述成分按其含量混合均匀，灭菌即可。以上为影响转化效率的5个重要因素：预培养时间、侵染时间、农杆菌菌液浓度、共培养时间、as浓度的选择得到最佳条件是：预培养时间是1天，侵染时间为20min，农杆菌菌液浓度为od0.4～0.6，共培养时间为2天，as浓度为0.2mmol，所述的共培养基每升含有花宝一号3g、6-ba2.0mg、naa0.2mg、as200μmol，余量为水，增殖培养基为每升含有花宝一号3g、6-ba3.0mg、naa0.3mg、潮霉素5mg和头孢霉素500mg，余量为水。实施例3农杆菌转化法将绿色荧光蛋白转入竹叶兰将竹叶兰的芽接种于原球茎诱导培养基(每升含花宝一号3g、naa0.2mg、6ba0.2mg，余量为水)中，暗处理30d后，在芽切口处处可以看到浅绿色小原球茎。移到光周期为16h/d，光照强度保持在40μmo1·m-2·s-1条件下培养30天后，原球茎变绿，且体积变大，取直径为0.5cm原球茎为受体材料。将直径为0.5cm原球茎在预培养条件为光强40μmo1·m-2·s-1，周期16h/d，环境温度为24±1℃，相对湿度55％，预培养基每升含有花宝一号3g、naa0.2mg、6-ba2mg，余量为水，进行预培养1天后，浸泡于od600为0.5的农杆菌菌液中侵染20min，转移至共培养基(花宝一号3g/l+6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l+as200μmol/l，溶剂为水)中避光培养，在23～25℃培养2天后，将原球茎依次用含0.05％m/v吐温的灭菌水清洗一次，用无菌水清洗三次，用含500mg/l头孢霉素的无菌水清洗三次，并在最后一次清洗过程中漩涡震荡30分钟，去除多余农杆菌，转移至增殖培养基(筛选培养基)(花宝一号3g/l+6-ba3mg/l+naa0.3mg/l+潮霉素5mg/l+头孢霉素500mg/l，溶剂为水)中进行抗性苗筛选，在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养，培养2周后，在荧光显微镜下观察到了抗性芽植物，随后进行了pcr检测，结果如图6所示，抗性植株(line1-8号条带)均扩增出相同的条带，而未经转化植株(wt)无此条带，证明目的基因已整合到竹叶兰原球茎基因组中。此后每2周继代一次，持续筛选2个月后，移至芽诱导培养基(花宝一号3g/l+naa0.5mg/l+潮霉素5mg/l+头孢霉素500mg/l，溶剂为水)上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，持续培养3个月，得到5～6cm高的墨绿色小苗进行炼苗移栽，所述的竹叶兰遗传转化及抗性植株的再生过程见图7所示。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12