一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法与流程

本申请属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法。

背景技术

碱性蛋白酶（alkalineprotease）是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类，广泛存在于动、植物及微生物生物体中，在猪的胰脏中最早被发现。研究表明，碱性蛋白酶大都属于丝氨酸蛋白酶，酶活性中心含有丝氨酸，等电点pi值多数在8.0左右，其分子量一般在15-40kda。

碱性蛋白酶作为一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、皮革、洗涤剂、酿造等行业，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤剂。而食品方面的应用主要用于蛋白类食品的发酵、肉类嫩化、酒精澄清等。由于用途及应用范围十分广泛，因此产业内每年对碱性蛋白酶的需求量都很大，并呈持续增长趋势，为此，如何持续提高碱性蛋白酶的发酵活力及提高碱性蛋白酶产量是业内迫切需要关注和解决的技术问题。

技术实现要素：

本申请目的在于提供一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，从而为碱性蛋白酶的生产、应用奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，该方法具体包括如下生产步骤：

（1）菌种活化

以地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）作为发酵菌株，首先将低温冰箱中保存的地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）原种接种到lb平板培养基上，37℃恒温培养24小时以进行菌种复苏，然后将活化后地衣芽孢杆菌接入斜面培养基，好氧条件下35~38℃培养28~36h以进行活化菌株；

所述斜面培养基，为固态，质量百分含量计，具体组成为：蛋白胨0.4%，牛肉膏0.2%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.6%，ph自然；

所述地衣芽孢杆菌发酵菌株具体例如采用中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏号为cicc10266的地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）菌株；

（2）种子培养

将步骤（1）中复苏、活化后菌种接入种子培养基中（质量比例计，接种量0.5~2%），35~38℃恒温、180~250r/min转速摇床培养28~37h，以此作为种子液；

所述种子培养基，为液态，以质量百分比计，培养基中含有：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠1%、葡萄糖2%；

将种子液按1~3%的体积比例接种入含有灭菌后一级种子培养基的发酵罐中，35~38℃、210~270r/min（优选37℃、180r/min）发酵培养20~30h，以此作为一级种子液；

所述一级种子培养基，以质量百分含量计，培养基组成为：葡萄糖0.5%，玉米淀粉2%，棉仁蛋白粉1.2%，磷酸二氢钾0.2%，ph自然；

发酵过程中，发酵罐压保持在0.05~0.08mpa，发酵液与通气量比（v/v▪min）为1：0.45~0.8（优选1：0.6）；

发酵结束后，应进行镜检，确保无杂菌感染；

（3）发酵制备碱性蛋白酶

将步骤（2）中所制备一级种子液按3~8%的体积比例接种入发酵培养基，35~38℃、180~210r/min（优选37℃、180r/min）发酵培养20~30h；再补充补料培养基，同样条件下继续发酵培养20~24h；优选方式为，先在发酵培养基中发酵培养24h，补充补料培养基后，再发酵培养24h（即发酵培养至48h）；

发酵过程中，发酵罐压保持在0.05~0.08mpa，发酵液与通气量比（v/v▪min）为1：0.45~0.8（优选1：0.6）；

所述发酵培养基，为液态，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：玉米淀粉（或可溶性淀粉）1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%，余量为水；

进一步优化配方为：玉米淀粉2~3%、棉仁蛋白粉1~2%、磷酸氢二钠0.15~0.25%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%；

具体的较佳配方为：玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.025%；

所述补料培养基，为玉米糖浆和棉仁蛋白粉的混合物，以质量比计算，玉米糖浆：棉仁蛋白粉=5~8：2~3；或者说，补充补料培养基时，以质量比例计，玉米糖浆的用量为补充前发酵液总质量的5~8%，棉仁蛋白粉用量为补充前发酵液总质量的2~3%；

发酵结束后所得即为含有碱性蛋白酶的发酵液，进一步按现有技术进行过滤、提纯等操作即可制备碱性蛋白酶成品。

本申请中，通过对发酵工艺及发酵培养基进行优化，尤其是在发酵后期通过补充特定营养糖和氮源等营养成分，较好提高了发酵活力。测定结果表明，本申请通过工艺优化后，发酵活力可达5.8万u/ml以上，远高于现有的已报道3.5万u/ml的发酵水平（孙同毅等，高产碱性蛋白酶菌株hap26选育，氨基酸和生物资源，2007年02期），表现出较好的提升效果，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为不同碳源形式对产酶的影响；

图2为玉米淀粉用量对发酵产酶的影响；

图3为棉仁蛋白用量对产酶影响；

图4为磷酸氢二钠用量对产酶影响；

图5为磷酸二氢钾用量对产酶的影响；

图6为氯化钙用量对产酶的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

物料情况：

玉米淀粉（水分≤14%）：黑龙江乾朗生物科技有限公司生产；

可溶性淀粉（水分≤14%）：诸城兴茂玉米开发有限公司生产；

棉仁蛋白粉（蛋白含量≥49.9%）：兴化市兴农棉仁蛋白加工厂生产；

玉米糖浆（de值＞60%）：孟州金玉米公司产品；

磷酸氢二钠（na2hpo4≥98%）：苏州蓝翔化工科技有限公司产品；

磷酸二氢钾（kh2po4≥98%）：武汉无机盐公司产品；

氯化钙（cacl2≥95%）：潍坊海滨化工有限公司产品；

发酵菌株：

下述实施例中所采用的地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：cicc10266，为一种可公开获得的工业生产用菌株。

实施例

以地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）cicc10266菌株为例，就本申请所提供提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法简要介绍如下。

（一）菌种活化

首先将低温冰箱中保存的地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）原种接种到lb平板培养基上，37℃恒温培养24小时以进行菌种复苏，然后将活化后地衣芽孢杆菌接入斜面培养基，好氧条件下37℃培养36h以进行活化菌株；

所述斜面培养基，为固态，质量百分含量计，具体组成为：蛋白胨0.4%，牛肉膏0.2%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.6%，ph自然。

（二）种子培养

将步骤（1）中复苏、活化后菌种接入种子培养基中（质量比例计，接种量1%），37℃、220r/min转速摇床培养36h，以此作为种子液；

所述种子培养基，为液态，以质量百分比计，培养基中含有：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠1%、葡萄糖2%；

将种子液按2%的体积比例接种入含有灭菌后（121~123℃实消40~45分钟后，培养基降温至38℃左右再进行接种）一级种子培养基的发酵罐中，37℃、180r/min发酵培养24h，以此作为一级种子液；

所述一级种子培养基，以质量百分含量计，培养基组成为：葡萄糖0.5%，玉米淀粉2%，棉仁蛋白粉1.2%，磷酸二氢钾0.2%，ph自然；

发酵过程中，发酵罐压保持在0.06mpa左右，发酵液与通气量比（v/v▪min）为1：0.6；

发酵结束后进行镜检，确保无杂菌感染。

（三）发酵制备碱性蛋白酶

将步骤（2）中所制备一级种子液按4%的体积比例接种入发酵培养基，37℃、180r/min发酵培养24h；

所述发酵培养基，营养成分包括：碳源、氮源棉仁蛋白粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙；

由于发酵24h后，发酵液中碳源、氮源营养成分会被大量消耗，对于进一步提升发酵酶活会有较大限制，因此需要适当补充氮源和碳源作为营养来源，以延长发酵时间，从而进一步提升发酵液酶活，补充营养时以补料培养基形式来补充，补充营养后，继续发酵24h；

所述补料培养基，为玉米糖浆和棉仁蛋白粉的混合物，补充补料培养基时，以质量比例计，玉米糖浆的用量为补充前发酵液总质量的5%，棉仁蛋白粉用量为补充前发酵液总质量的3%（也即，玉米糖浆用量为原始发酵液中玉米淀粉用量1倍，棉仁蛋白粉用量为原始发酵液中棉仁蛋白粉用量1倍）；

发酵过程中，发酵罐压保持在0.06mpa左右，发酵液与通气量比（v/v▪min）为1：0.6；

发酵结束后对含有碱性蛋白酶的发酵液进行酶活测定，以评价发酵效果。

需要说明的是，上述发酵制备碱性蛋白酶过程中，为确定发酵培养基的较适营养成分组成，发明人进行了一些列单因素实验，下面就相关实验过程及实验结果简要介绍如下。

（1）不同碳源对发酵酶活影响

参考上述过程，针对发酵培养基中碳源形式进行了实验分析，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：

碳源（玉米淀粉、葡萄糖、可溶性淀粉或者麦芽糊精）3%、棉仁蛋白粉2%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.02%。

发酵结束后，对不同碳源形式的发酵液中碱性蛋白酶酶活进行检测，结果如图1所示。对图1分析可以看出，相同用量情况下，可溶性淀粉和玉米淀粉对菌株的产酶最有利，但由于实际生产中可溶性淀粉价格较高，因此选用玉米淀粉作为碳源较为适宜。

（2）玉米淀粉的最适用量

在确定最适碳源形式后，发明人进一步对玉米淀粉不同用量情况下对发酵液酶活影响情况进行了分析，具体实验时，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：

玉米淀粉（用量分别为：1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%）、棉仁蛋白粉2%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.02%。

发酵结束后，对发酵液中碱性蛋白酶酶活进行检测，结果如图2所示。对图2分析可以看出，玉米淀粉不同用量时对发酵液酶活影响不同，在初始阶段，随着玉米淀粉使用量增加，发酵液酶活呈明显上升状态，但随着玉米淀粉使用量增加，发酵液酶活则呈下降状态。综合而言，玉米淀粉用量以1.5~3.5%为宜，较优用量范围为2~3%。

（3）氮源用量对发酵液酶活影响

本申请中，以棉仁蛋白粉作为氮源，在上述实验基础上，发明人进一步对氮源用量不同时对发酵液酶活影响情况进行了实验分析，具体实验时，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：

玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉（0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、）、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.02%。

发酵结束后，对发酵液中碱性蛋白酶酶活进行检测，结果如图3所示。对图3分析可以看出，氮源不同用量时对发酵液酶活影响不同，在初始阶段，随着棉仁蛋白粉使用量增加，发酵液酶活呈明显上升状态，但随着棉仁蛋白粉使用量增加，发酵液酶活则呈持续下降状态。综合而言，棉仁蛋白粉用量以0.5~2.5%为宜，较优用量范围为1~2%。

（4）其他辅助性影响因素影响

参考上述实验设计，发明人进一步对发酵培养基中辅助性营养成分磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙的用量不同时对发酵液酶活影响情况进行了实验分析，以质量百分含量计，

针对磷酸氢二钠这一影响因子进行实验分析时，发酵培养基中含有：

玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%）、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.02%；

针对磷酸二氢钾这一影响因子进行实验分析时，发酵培养基中含有：

玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%）、氯化钙0.02%；

针对氯化钙这一影响因子进行实验分析时，发酵培养基中含有：

玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙（0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%）。

发酵结束后，对发酵液中碱性蛋白酶酶活进行检测，结果分别如图4、图5、图6所示。分析可以看出，不同影响因素对发酵液酶活影响情况与氮源、碳源影响情况有一定类似性。综合而言，

磷酸氢二钠的用量以0.1~0.3%较为适宜；较优用量范围为0.15~0.25%；

磷酸二氢钾的用量以0.1~0.2%较为适宜；较优用量为0.15%；

氯化钙的用量以0.02~0.03%较为适宜；较优用量为0.25%。

综合上述实验，发酵培养基配方较优配方为：玉米淀粉1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%；

进一步优化配方为：玉米淀粉2~3%、棉仁蛋白粉1~2%、磷酸氢二钠0.15~0.25%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%；

具体的较佳配方为：玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.025%。

（5）补料对发酵产酶的影响

在上述确定最适碳源、氮源及其他辅助性物料用量基础上，针对发酵工艺中不同补料时机及不同补料量对发酵产酶的影响情况，发明人进行了进一步分析，具体而言，发酵实验中，以质量百分含量计，发酵培养基及补料量情况如下表（30m³发酵罐）所示：

配料及补料用量表

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需要解释和说明的是，发酵过程中，在发酵24h后开始补料，补料操作时，采用匀速添加方式进行补料操作，从24h开始添加，直至46h左右补料完毕，在补料添加开始后再发酵24h（即，从原始发酵开始，至最终发酵结束共发酵48h），对不同时间点的发酵酶活进行检测检测，结果表明，随着补料量的持续添加，发酵酶活也持续提高，在发酵至48h时，发酵液中碱性蛋白酶活力可达58315u/ml，表现出较好的持续提升效果。而进一步的延长发酵时间或者其他补料比例及再补料实验效果均表明，发酵液中碱性蛋白酶活提升效果不如此技术方案明显，甚至有所降低。因此，补料后再继续发酵24h是较优的技术方案，而补料比例方面，补料量是原发酵液中玉米淀粉和棉仁蛋白粉多1倍（2倍）用量为宜。