一种经热稳定性改造的角蛋白酶突变体的制作方法

本发明涉及一种经热稳定性改造的角蛋白酶突变体，属于工业生物技术领域。

背景技术

角蛋白结构复杂、刚性强，含有丰富的二硫键，因此难以被普通蛋白酶降解。角蛋白酶是能够特异性降解羽毛、羊毛、毛发、指甲等富含角蛋白的特殊的蛋白酶类。其首先通过二硫键还原作用打开角蛋白中复杂的二硫键，进而通过蛋白水解作用实现角蛋白的降解。角蛋白酶的特殊性使其能够广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中。

总结已有研究来看，角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。其中热稳定性不足的问题使得在实际应用中通常需要通过加热来加速反应，提高了能耗，且角蛋白酶粉制备时的喷雾干燥过程也需要加热，因此，热稳定的角蛋白酶在实际应用中非常重要。提高酶热稳定性的方法包括添加保护剂、酶的化学修饰、固定化以及蛋白质工程改造等。基于蛋白质三维结构的定点突变改造是改变酶热稳定性的有效方法，近年来，建立在分子信息学基础上的蛋白质工程技术获得了长足的发展，基于蛋白质的晶体结构或同源模型，利用计算机辅助设计能对角蛋白酶进行半理性或理性的蛋白质工程改造，为提高角蛋白酶的热稳定性提供可行的技术手段。美国国立生物技术信息中心(ncbi)和蛋白质数据库(pdb)中存在角蛋白酶保守位点和蛋白质结构等信息，通过对信息的初步检索、分析以及进行计算机预测，确定热稳定性改造的潜在位点，进而构建突变体，进行体外实验验证，考察重组酶的表达情况及其热稳定性。

随着绿色产业的推动，迫切需要角蛋白酶产业化的实现，但目前角蛋白酶的稳定性总体仍未达到商业化应用的需求。早期研究中本课题组也对角蛋白酶(bpker)进行了热稳定性改造，但亲本的酶活明显偏低，发酵最高酶活仅为70u/ml(cn107828765a)。课题组前期已构建获得一株具有高角蛋白水解酶活的角蛋白酶kerbv重组菌，在5l发酵罐上角蛋白酶活力高达7000u/ml以上，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平。但是该菌株的热稳定性还不适用于工业应用。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明在构建角蛋白酶kerbv三维结构模型的基础上，采用定点突变改造策略提升角蛋白酶的热稳定性，重点对热稳定性影响关键的loop区域中的位点进行突变改造，提高该高酶活重组菌所产角蛋白酶的稳定性，将能够更好地服务于应用，具有更大的市场价值及应用潜力。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，以氨基酸序列如seqidno.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶的第118位天冬酰胺、第218位天冬酰胺、第236位丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第118位天冬酰胺突变为丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第218位天冬酰胺突变为丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第236位丝氨酸突变为半胱氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的角蛋白酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述角蛋白酶突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母、丝状真菌中的任意一种为宿主菌。

本发明的第五个目的是提供所述的角蛋白酶突变体在畜牧行业、饲料行业、制革行业、纺织行业、医药行业中的应用。

在本发明的一种实施方式中，用于降解硬质角蛋白、处理废弃角蛋白资源。

本发明的有益效果是：本发明基于角蛋白酶三维结构模型，针对角蛋白酶的酶蛋白loop区域上的8个关键氨基酸残基位点，采用一步反向pcr构建热稳定性突变重组菌，热稳定性研究结果显示突变体n218s角蛋白酶在60℃的热稳定性提高了3倍以上。利用角蛋白酶进行降解羽毛研究。观察到角蛋白酶处理48h后的羽毛表面呈现开叉、毛糙状，羽毛降解率达到25％，羽毛降解液中氨基酸总含量增加了1.82mg/ml。该研究为降解羽毛制备高质量饲料以及降解硬质角蛋白废弃物奠定了基础。

附图说明

图1为突变重组菌的菌落pcr验证；

图2为突变重组菌的相对酶活及热稳定性情况；

图3为突变体n218s与对照菌在60℃热稳定性比较；

图4为突变体n218s热稳定性提高的分子机制；a：突变前218位asn；b：突变后218位ser；

图5为羽毛降解前(a)和降解后(b)的扫描电镜观察。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

角蛋白酶酶活检测方法：

角蛋白酶酶活以市售可溶性角蛋白为底物进行检测。

1％角蛋白底物溶液的配制：首先配制0.1mtris-hcl(ph9.0)溶液，然后加入5％可溶性角蛋白母液，再加入去离子水使tris-hcl溶液浓度稀释为0.05m，并且使角蛋白溶液浓度稀释为1％。

酶反应：取适度稀释酶液100μl，加入100μl底物溶液，置50℃水浴中准确反应15min，反应结束后立即加入200μl5％(w/v)tca终止反应。对照组中先加入200μltca，酶反应结束后再加入100μl底物溶液。上述反应结束后所有样品均以12000rpm离心5min，然后分别吸取200μl上清液到新离心管中，加入1ml0.4mna2co3，再加入200μl福林酚溶液，置40℃水浴显色反应20min后在680nm处检测吸光值。

酶活定义：在上述反应条件下，酶液水解底物在680nm下产生0.01的吸光度的差别定义为一个酶活单位u。

酶活计算公式：u＝(a－b)×100×n

a：表示实验组在680nm处的吸光度值；b：表示对照组在680nm处的吸光度值；100：表示吸光度差为1需乘100；n：表示稀释倍数。

实施例1：定点突变和重组菌构建

高柔性loop区域往往是酶分子结构中对热不稳定、容易首先发生去折叠的部分，本研究中选择氨基酸序列为seqidno：2的角蛋白酶高柔性loop区域上的8个关键氨基酸位点(s78l、l96t、n118s、n123y、s173r、n218s、m222a、s236c)进行突变改造研究。

利用一步反向pcr方法构建角蛋白酶定点改造突变体，图1所示为各突变体菌落pcr验证结果，图中1800bp处条带与利用质粒通用引物扩增得到的目的片段大小一致。进一步测序验证后，将正确构建的定点突变改造质粒转化到宿主细胞中。

实施例2：突变重组菌热稳定性

将正确构建的各突变位点重组菌经平板划线分离出单菌落，挑取单菌落至lb培养基(kan)中培养8-12h，以2％接种量接种至tb发酵培养基(kan)中发酵培养30h，取发酵上清即各突变重组酶在60℃热处理15min，分别检测热处理前后酶活。以未突变且未在60℃热处理的原始酶酶活作为100％。结果如图2所示，只有n118s、n218s、s236c这三个突变体酶活水平与初始对照菌保持一致，其余均表现为酶活下降。经热处理后，n118s和n218s突变酶剩余酶活高于对照菌。118位改造的提升效果可能是归因于其未进行热处理的初始酶活就高于对照菌，而218位突变改造表现出热稳定性的绝对提升。

评价重组酶突变前后半衰期t1/2实验中，选择重组酶稳定性较差的60℃进行检测。分别将未突变原始酶和各突变酶在60℃下进行热处理，每隔一段时间取出部分检测剩余酶活，以未进行热处理的酶活作为100％。对前期实验中热稳定性提升效果较好的n218s突变酶进行进一步热稳定性研究，由图3可知，与初始对照相比，n218s突变酶在60℃的热稳定性得到了显著提高，其在60℃的半衰期t1/2由突变前14.7min提高至突变后50.6min，为对照的3.4倍。

对目标改造位点突变前后分子间作用力进行分析，结果发现，218位点由天冬酰胺突变为丝氨酸后，该位点与邻位酪氨酸之间能形成更短且作用力更强的氢键(图4)，推测该氢键作用是使突变酶热稳定性提高的主要原因之一。另外，具有羟基的丝氨酸可能也是形成氢键并增强催化中心稳定性的活性残基。

实施例3：角蛋白酶降解羽毛降解情况分析

将改造的角蛋白酶热稳定性提升的重组菌在优化培养基的条件下进行发酵产酶，并配制成1000u/ml的羽毛降解酶液，然后取60ml羽毛降解酶液加入到含0.6g羽毛粉的250ml锥形瓶中，将反应体系置于40℃、220rpm进行反应，每隔一段时间观察羽毛降解情况并且取样进行反应液成分检测。结果显示，反应48h后，角蛋白酶表现出较好的羽毛降解效果，从初始完整的羽毛逐步降解成细小的纤维，羽毛的梗茎较难降解，但明显比初始梗茎更纤细。经扫描电镜观察，羽毛降解前后的情况如图5所示，可以清晰地观察到羽毛光滑平整的表面变得开叉、粗糙，其表面的角蛋白经降解而缺失，造成羽毛表面破碎程度的显著提升。

取不同时间的羽毛降解反应液，以12000rpm离心5min，取上清液适度稀释后用bradford试剂检测蛋白浓度，另取500μl上清液与等体积的10％(w/v)tca混匀，后再以12000rpm离心5min，取上清液过0.22μm微孔滤膜过滤后利用高效液相检测样品中氨基酸的组成及含量。在测定不可溶性干物质含量时，首先把羽毛降解反应结束后的反应液用滤纸进行过滤，然后用去离子水冲洗滤渣三次，以充分除去滤渣表面的可溶性成分，将冲洗过的滤渣烘干后称重，比较反应前后不溶性干物质的含量，计算羽毛降解率。

分析羽毛降解前后干物质含量，在降解48h后，羽毛角蛋白由0.60g减少到0.45g，羽毛降解率为25％。羽毛降解液中降解前后游离氨基酸含量变化如表1所示，降解后赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸等含量增加较多，氨基酸总含量增加了1.82mg/ml(表1)，这表明降解羽毛可以得到大量的氨基酸即大量的氮源，既满足了饲料行业对氮源的需求，也增强了羽毛粉的营养价值，同时，传统方法降解含有硬质角蛋白的羽毛需设计高温或高压及使用化学试剂等，生物法特异性降解羽毛具有条件温和、降解效果好、绿色环保等优点。此外，羽毛粉中大量的氮源还可以为庄稼植物等提供廉价的肥料，改善土壤结构，缓解水土流失的危机，减小污染，保护环境等。

表1氨基酸浓度变化

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种经热稳定性改造的角蛋白酶突变体

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1149

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>1

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<213>（人工序列）

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