一种纳豆激酶干燥保护剂的制作方法

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种纳豆激酶干燥保护剂。

背景技术

1987年，日本sumi博士于纳豆中发现了一种能有效溶解心脏和大脑中血栓的酶—纳豆激酶（nattokinase，nk），从此开始了对nk的应用与研究。纳豆激酶由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于uk、sk、tpa的蛋白质，是由纳豆在发酵过程中产生的丝氨酸蛋白酶，可将纤维蛋白水解成小肽和氨基酸，并具有良好的溶栓能力，且在降血压，预防心脑血管疾病等方面也具有一定疗效。目前医学上批准应用的溶栓药物有：链激酶（streptokinase，sk）和尿激酶（urkinase，uk）等，但它们均在一定程度上有某种缺陷，如药效时间短、易出血等。与现有的溶栓类药物相比，纳豆激酶源自传统食品，不仅价格低廉，安全性高，且纳豆激酶体内半衰期长，可被肠道吸收，不易引起出血，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tpa，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性，因此受到了生物医学和食品界的广泛关注。近年来，国内市场上纳豆激酶胶囊种类繁多，但纳豆激酶的溶纤度和活性却相对较低。如何提高纳豆激酶经干燥过程后的活性和稳定性，从而扩大其商业和临床方面的应用是目前该酶的研究热点。

我国是大豆的故乡，豆制品行业每年约产生数千万吨湿豆渣，如此大的产量却只能用作动物饲料甚至被丢弃浪费十分可惜，究其原因是由于豆渣的热能低、口感差，对其综合利用是增加其附加值和减少环境污染的重要途径，因此，近年来，豆渣的综合利用已成为各国研究工作者关注的问题之一。豆渣中含有丰富的纤维素、蛋白质、脂肪、维生素和微量元素，且豆渣中所含热量很少，其中纤维素的含量占据了干物质的一半，是极好的膳食纤维原料。若以豆渣为原料生产富含纳豆激酶的产品，是提高豆渣品质和附加值的非常可行的途径。我们的前期研究表明，豆渣为基质生产纳豆激酶，其酶活性与大豆基质的纳豆激酶产量媲美，但是并没有研究其干燥工艺及酶活稳定性。目前报道的纳豆激酶干燥方法一般为真空冷冻干燥法和喷雾干燥法，但是干燥过程酶活性损失严重。因此开发一种能够降低纳豆激酶在干燥过程酶活性损失的保护剂具有重要意义。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种能够降低纳豆激酶在干燥过程酶活性损失的纳豆激酶干燥保护剂。

一种纳豆激酶干燥保护剂，它包括：海藻糖；

所述的一种纳豆激酶干燥保护剂，还包括麦芽糊精；

所述的海藻糖和麦芽糊精的质量比为2:1~4；

所述的海藻糖和麦芽糊精的质量比为2:1。

一种纳豆激酶干燥保护剂的制备方法，它包括：按海藻糖、麦芽糊精质量比为2:1~4分别称取海藻糖与麦芽糊精，加入蒸馏水，搅拌，获得纳豆激酶干燥保护剂。

一种纳豆激酶干燥方法，它包括：将纳豆激酶粗酶液与所述的一种纳豆激酶干燥保护剂按体积比1:2~5混合，均质，喷雾干燥，收集纳豆激酶酶粉；

所述的纳豆激酶粗酶液，是由下述方法制备的：

1）发酵剂的制备：纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释，接入到含1~3%琼脂的lb培养基上培养15~20h，挑取单菌落接入lb液体培养基中，活化，按2~4%接种量接于lb液体培养基，35~38℃培养10~15h；冷冻离心，将离心后的菌体洗涤，重悬，使菌悬液浓度调整至10⁷cfu/ml，获得发酵剂；

2）豆渣的发酵：大豆用水浸泡12~16h，沥水，按质量比1:5~10加水，磨浆，过滤，得到新鲜豆渣，调整豆渣的水分含量80~90%，高温灭菌，冷却，按6~10%的接种量接种至步骤1）的发酵剂中，35~40℃恒温发酵22~26h，0~4℃后熟20~30h；

3）纳豆激酶粗酶液的制备：步骤2）后熟的豆渣，按重量比1：3~7加生理盐水，0~4℃浸提4~8h，以3000~4000r/min离心10min，收集上清液，用0.22~0.45µm的微孔滤膜除菌，得到纳豆激酶粗酶液；

所述的均质为9000~12000r/min均质1~3分钟；

所述的喷雾干燥条件为进口温度140~160℃，出口温度70~80℃，蠕动泵转速为240~440ml/h。

本发明提供了一种纳豆激酶干燥保护剂，它包括：海藻糖；还包括麦芽糊精；海藻糖和麦芽糊精的质量比为2:1~4；制备方法，它包括：按海藻糖、麦芽糊精质量比为2:1~4分别称取海藻糖与麦芽糊精，加入蒸馏水中，搅拌，获得纳豆激酶干燥保护剂；一种纳豆激酶干燥方法，它包括：将纳豆激酶粗酶液与一种纳豆激酶干燥保护剂按体积比1:2~5混合，均质，喷雾干燥，收集纳豆激酶酶粉；生产的纳豆激酶酶活平均值为(210200±19126)fu/g；本发明优点在于：1）利用豆渣为基质生产纳豆激酶，提高豆渣附加值，其酶活性与大豆基质的纳豆激酶产量媲美；2）降低了干燥过程酶活性损失，提高纳豆激酶稳定性。

附图说明

图1纳豆芽孢杆菌显微镜形态；

图2不同喷雾干燥条件下纳豆激酶的活性；（a）进口温度对酶活的影响，（b）蠕动泵转速对酶活的影响，（c）保护剂类型对酶活的影响；

图3不同保护剂下冷冻干燥后纳豆激酶稳定性的比较结果；（a）海藻糖保护剂，（b）麦芽糊精保护剂，（c）乳清蛋白粉保护剂，（d）混合保护剂ⅰ，（e）混合保护剂ⅱ；

图4不同保护剂下喷雾干燥后纳豆激酶稳定性的比较结果；（a）海藻糖保护剂，（b）麦芽糊精保护剂，（c）乳清蛋白粉保护剂，（d）混合保护剂ⅰ，（e）混合保护剂ⅱ。

具体实施方式

实施例1纳豆激酶粗酶液的制备

1、菌种的活化与菌悬液的制备

购买纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释成10^-3至10^-6不同梯度平板划线于含有2%琼脂的lb培养基上培养18h进行镜检如图1，然后挑取单菌落接入lb液体培养基中，活化三代，然后按3%接种量接于lb液体培养基中120rpm，37℃培养12h；菌液在高速冷冻离心机中，4℃、8000r/min离心10min；将离心后的菌体用无菌水洗涤两次，重悬，使菌悬液浓度调整至10⁷cfu/ml，作为发酵剂。

2、鲜豆渣的发酵

将大豆在室温下用蒸馏水浸泡14h后进行磨浆（大豆：水=1：9（w/w））,用100目滤布过滤，得到新鲜豆渣，调整豆渣的水分含量约为85%，于121℃灭菌20min。冷却后按8%(v/w)的接种量接种10⁷cfu/ml的纳豆芽孢杆菌发酵剂。将接种纳豆芽孢杆菌的豆渣于38℃恒温培养箱中前期发酵24h后，放置于4℃冰箱中后熟24h。

3、纳豆激酶粗酶液的制备

后熟后的豆渣中按重量比1：5(w/w)加入无菌生理盐水，4℃浸提6h，以3800r/min离心10min，收集上清液；将上清液依次用0.45µm和0.22µm的微孔滤膜除菌，得到纳豆激酶粗酶液，放置于4℃冰箱中冷藏备用。

实施例2纳豆激酶干燥保护剂的制备

分别制备海藻糖保护剂、混合保护剂ⅰ、混合保护剂ⅱ、麦芽糊精保护剂、乳清蛋白粉保护剂，用于后续实验，制备方法具体如下：

1、海藻糖保护剂：称取海藻糖18g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

2、混合保护剂ⅰ：分别称取麦芽糊精6g、海藻糖12g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

3、混合保护剂ⅱ：分别称取麦芽糊精6g、β-环状糊精2g、乳清蛋白粉10g加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

4、麦芽糊精保护剂：称取麦芽糊精18g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

5、乳清蛋白粉保护剂：称取乳清蛋白粉18g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在。

实施例3纳豆激酶粗酶液干燥工艺实验

一、纳豆激酶粗酶液喷雾干燥条件优化

按照纳豆激酶粗酶液与实施例2制备的各类保护剂按体积比1:3（v/v）的比例混匀，10000r/min均质2分钟后进行喷雾干燥，设定喷雾干燥机进口温度分别为140、150、160℃，出口温度75℃，蠕动泵转速分别为240、340、440ml/h，风机速度70hz，撞针时间1s，撞针间隔1s，干燥后收集酶粉进行活性测定，考察保护剂种类、喷雾干燥进口温度、喷雾干燥蠕动泵转速对纳豆激酶活性的影响。

以纳豆激酶活力为考核指标，确定各单因素合适的喷雾干燥条件，为喷雾干燥纳豆激酶的条件优化提供参考范围，试验设计的每个因素设置3个平行；研究不同喷雾干燥条件下纳豆激酶的活性，结果如图2a；结果表明，在保护剂相同（混合保护剂ⅱ）和蠕动泵转速（340ml/h）的条件下，随着进口温度的上升，纳豆激酶部分失活，酶活力逐渐降低，在进口温度低于140℃时，收集瓶口会有少量糊状物体生成，影响喷雾干燥结果。糊状物体可能是由于喷雾干燥温度较低或蠕动泵转速较快导致干燥不完全；图2b结果表明在相同进口温度（150℃）、同种保护剂（海藻糖保护剂）的条件下，最适蠕动泵转速为340ml/h，此时纳豆激酶活性最大；在蠕动泵转速为240ml/h时，可能由于蠕动泵转速过慢导致纳豆激酶在高温条件下逐渐失活；在蠕动泵转速为440、540ml/h时，可能由于蠕动泵转速过快，粗酶液干燥不完全，产率下降，从而导致酶活降低；图2c结果表明，在相同进口温度（150℃）、蠕动泵转速（340ml/h）的条件下，此时纳豆激酶活性最大；重复三次试验，得纳豆激酶酶活平均值为(210200±19126)fu/g。

纳豆激酶的纤溶活力测定采用纤维蛋白平板法，以纳豆激酶溶解纤维蛋白平板所产生的溶解圈直径表示纳豆激酶的活性；纳豆激酶的活力是以其相对于尿激酶的活力单位来表示，建立尿激酶的活力线性回归方程为：y=0.0023x+0.8207，r²=0.998；

纳豆激酶的酶活力(fu/g)＝a×4，式中：a—样品测得的利用尿激酶标准曲线计算得到相应纳豆激酶酶活力单位(fu/g)；4—待测纳豆激酶样品的稀释倍数。

二、纳豆激酶稳定性的检测

通过冷冻干燥和喷雾干燥的方法，分别进行纳豆激酶的干燥，测定其酶活力；同时考察不同类型的保护剂对纳豆激酶酶活的影响；具体操作如下：

在确定相同进口温度（160℃）、蠕动泵转速（340ml/h）条件下，实施例2制备的不同保护剂保护粗酶液，进行喷雾干燥；取10ml实施例2制备的各保护剂与粗酶液混合均质后的溶液，在-20℃冰箱中预冻2h后移至-80℃冰箱冷冻12h，将冷冻后的粗酶液移至真空冷冻干燥机进行冻干；上述两种方法得到纳豆激酶粉末，分别取200mg装入1.5ml离心管中，将离心管与干燥剂放入袋中真空包装，分别在0℃、4℃、常温（约18℃）、37℃条件下保存40天，每隔十天进行一次纳豆激酶酶活的测定。

为进一步讨论不同保护剂进行干燥后所产生纳豆激酶活力的稳定性，本实验对保藏温度和保藏时间对纳豆激酶活力稳定性的影响程度进行研究；通过图3可以看出，冷冻干燥的纳豆激酶在相同保藏温度的条件下，随着时间的增长不同保护剂的纳豆激酶活性均逐渐降低；在相同保藏时间、保藏温度的条件下，以海藻糖作保护剂进行冷冻干燥所产生的纳豆激酶活性最高。

通过图4可以看出，经喷雾干燥的纳豆激酶在相同保藏温度的条件下，随着时间的增长纳豆激酶活性均逐渐降低；在相同保藏时间，相同保藏温度的条件下，以混合保护剂ⅰ进行喷雾干燥所产生的纳豆激酶活性最高；在相同保藏时间、不同保藏温度的条件下，相同保护剂进行喷雾干燥产生的纳豆激酶活性无显著变化；综上所述，保藏温度对不同保护剂喷雾干燥产生的纳豆激酶活性均无较大影响，这可能与纳豆激酶在45℃以下和ph=7～9范围内酶活相对稳定有关；但是随保藏时间的增长，经不同保护剂喷雾干燥产生的纳豆激酶活性均逐渐降低与冷冻干燥的纳豆激酶活性呈相同趋势；因此以混合保护剂ⅰ为保护剂进行喷雾干燥后的纳豆激酶储存时间长，且较为稳定，大大提高了纳豆激酶的利用价值。