一种异黄酮衍生物的分离方法及应用与流程

本发明属于医药领域，涉及一种异黄酮在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病药物、保健品或化妆品中的应用。

背景技术

人口膨胀与工业科技的迅猛发展，导致环境污染问题日益加剧。多种污染物，如碳硫氮氧化物(co、so2、no2等)、重金属(铅、铬、砷等)、颗粒物、电磁辐射、化学有机试剂等，不断通过空气、水源、食物和皮肤接触等途径，侵袭人体组织器官，引起氧化应激。机体生成的大量脂质过氧化产物与过量的内源性活性氧、活性氮，作用于细胞，直接或间接地造成细胞内蛋白质、脂质、核酸等生物大分子损伤突变与功能抑制，进而诱发癌症，神经退行性疾病，心血管疾病，糖尿病，皮肤病和慢性阻塞性肺病等一系列严重疾病。因此，增强机体抗氧化能力，清除体内氧化活性产物，抑制细胞氧化损伤，对防治由氧化应激引发的相关疾病而言具有重要意义。

nrf2(nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2)信号通路是调控人体氧化应激的关键通路，是化学预防剂(药物)作用的优良靶点。核因子nrf2是保护细胞对抗氧化损伤的重要转录因子，当机体处于氧化应激状态，nrf2就被激活并转位进入细胞核，通过与抗氧化反应原件(are)结合，来编码gcl、ugt、nqo1、γgcs、cat、sod等ii相解毒酶及内源性抗氧化蛋白酶，从而清除体内有害毒物，降低氧化活性产物水平，恢复体内氧化还原平衡。但机体内氧化应激反应在激活nrf2通路的同时，生成的大量ros、自由基等有害物质，亦对组织器官造成严重损伤，进而诱发多种疾病发生。

因此，当机体暴露于亲电性异物、化学致癌物等损伤机体的环境污染物时，我们可以利用外源性nrf2激动剂，来提前上调组织中保护性蛋白酶的表达，及时降低组织中活性氧和毒物的水平，增强机体自身防御能力，进而对慢性阻塞性肺疾病、皮肤病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤疾病的发生发展产生预防作用。激活nrf2信号通路，能够上调ii相解毒酶水平，清除污染物中致癌物或降低其毒性，抑制致癌物诱导的dna损伤、基因突变，从而预防肿瘤的发生。上调nrf2表达，能够增加细胞内谷胱甘肽水平，增强抗氧化酶活性，清除细胞内活性氧，抑制细胞脂质过氧化，降低慢性阻塞性肺疾病、皮肤病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病等疾病的发病率。

近年来，人工合成抗氧化剂多为酚类化合物，如丁基羟基茴香醚(bha)、2,6-二叔丁基对甲酚(bht)。但由于其毒性和致癌作用，bha、bht已被立法机构限制使用。因此，从天然产物中寻找具有预防和治疗作用的安全、天然抗氧化剂，是抗氧化药物研发的重要途径。异黄酮是一种天然来源的雌激素结构类似物，其中大豆异黄酮，已被证明具有雌激素样作用，能够与女性体内雌激素竞争结合雌激素受体，调节人体内分泌，保持妇女体内雌激素水平平衡，从而达到美容养颜，延缓衰老，降低更年期综合征症状，预防雌激素流失所造成的冠心病、动脉粥样硬化和骨质疏松疾病等功效。此外相较于直接补充雌激素的雌激素代替疗法，大豆异黄酮具有更低的毒副作用，能规避更年期妇女患乳腺癌、子宫内膜癌的风险。

异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮(5-hydroxy-4,7’-dimethoxy-isoflavone)，与大豆异黄酮相较而言，其苯并吡喃-4-酮3位的取代基不是对羟基取代苯，而是对甲氧基取代苯，这种结构不仅加强了药物的脂溶性，更利于人体吸收，还增强了苯并吡喃-4-酮2位的亲电性，使其成为强活性的nrf2激动剂。但是，目前并未有文献对5-羟基-4，7‘-二甲氧基异黄酮进行活性检测。

技术实现要素：

为了解决现有技术不足，本发明提供一种异黄酮在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病药物、保健品或化妆品中的应用，能够预防和治疗慢性阻塞性肺疾病、皮肤病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤疾病。

本发明目的之一在于提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的分离方法，将红车轴草投入乙醇溶液中加热回流提取，浓缩滤液得浸膏，向浸膏中加水混悬溶解后，依次加入石油醚和乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯部分通过硅胶柱层析梯度洗脱后得到无色结晶，即5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

该5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的化学式为：

优选的，该分离方法的具体步骤如下：

(1)将红车轴草投入乙醇溶液中加热回流提取，合并滤液后浓缩得到乙醇浸膏；

(2)向步骤(1)得到的乙醇浸膏中加入适量水溶解，加入石油醚萃取后再加入乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取部位；

(3)向所述乙酸乙酯萃取部位加入硅胶搅拌，然后经硅胶柱层析梯度洗脱分离，所述硅胶柱层析的体系为二氯甲烷-甲醇系统，洗脱后得到九个部分，根据出峰时间记为fr.1-fr.9；

(4)将步骤(3)中得到的fr4进一步经硅胶柱层析梯度洗脱分离，所述硅胶柱层析的体系为二氯甲烷-甲醇系统，梯度洗脱后得到无色结晶，即5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

优选的，步骤(1)的具体操作为：将红车轴草投入8倍量的75％的乙醇溶液中加热回流三次，每次1.5h。

进一步优选的，红车轴草2kg，以8倍量75％乙醇为溶剂，加热回流提取3次，每次1.5小时，过滤合并滤液，浓缩得乙醇浸膏200g。

优选的，步骤(2)的具体操作为：向乙醇浸膏中加水溶解，加入石油醚萃取三次后，弃去石油醚部位，再加入乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，得到乙酸乙酯部位。

进一步优选的，萃取后得到乙酸乙酯部位45g。

优选的，步骤(3)中采用硅胶柱层析进行梯度洗脱，所用体系为二氯甲烷-甲醇，梯度洗脱程序为：二氯甲烷-甲醇系统体积比为100:0、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、60:40、50:50、0:100，洗脱后得到九个部分，记为fr.1-fr.9。

优选的，步骤(4)中采用梯度洗脱程序进行洗脱，具体程序为：二氯甲烷-甲醇系统体积比为93:7、88:12、80:20，在88:12体积比下的馏分有结晶析出，为5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

本发目的之二在与提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物中的应用。

本申请的发明人通过研究发现异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮能够上调nrf2及其调控的ii相脱毒酶nqo1和抗氧化酶γgcs蛋白水平，其激活机制是通过增加nrf2蛋白稳定性抑制nrf2蛋白降解实现；采用砷诱导的肺支气管上皮beas-2b细胞损伤模型，评价了异黄酮的细胞保护作用，结果表明该化合物能够增加细胞内源性抗氧化剂gsh水平，抑制砷诱导beas-2b细胞损伤和凋亡。

优选的，上述氧化应激诱发疾病为慢性阻塞性肺疾病、呼吸道炎症、皮肤病变、糖尿病、神经退行性疾病或肿瘤疾病。

优选的，在上述应用中，5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的治疗浓度为6.25～12.5μm，进一步优选的，为6.25μm。

优选的，上述应用中，5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮为胶囊剂、片剂、散剂、凝胶剂、颗粒剂、注射剂、口服液、酒剂、丸剂、合剂或酊剂。

本发明目的之三在于提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮片剂的制备方法，将异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮、淀粉及糊精混合后过筛，再加入羧甲基纤维素钠制粒，然后加入硬脂酸镁混合后压片即得片剂；优选的，其中异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮、淀粉及糊精质量比为1-2:2-3:2-3。

本发明目的之四在于提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮凝胶剂的制备方法，将卡波姆和聚山梨醇加入水中混均，再加入异黄酮混合均匀即得凝胶剂；优选的，该凝胶剂中异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮、卡波姆和聚山梨醇的质量比为2-3:3-4:1-2。

本发明目的之五在于提供一种具有抗氧化功效的化妆品，成份为5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮及一般化妆品原料。

优选的，上述化妆品可以为面膜、护肤霜、护肤膏、护肤水、护肤粉或护肤凝胶。

本发明的有益效果

1.本发明提供了一种从红车轴草中提取5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的方法，并验证了其抗氧化活性。现有技术中关于5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮分离方法的研究较少，关于其活性的研究更是空白，本发明提供了一种针对5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的高效提取方法，证明了其抗氧化活性是通过上调nrf2实现的，为相关靶点药物的研究提供了依据。

2.本发明验证了5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的抗氧化活性，该抗氧化性与多种疾病险关，如慢性阻塞性肺疾病、呼吸道炎症、皮肤病变、糖尿病、神经退行性疾病或肿瘤疾病等，对于以上疾病的治疗均提供了新的研究思路，具有重要的医学意义。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1nqo1的诱导活性试验的柱状图；

图1表明异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮能够诱导hepa1c1c7细胞ii相解毒酶nqo1的表达并增强其活性，图中的异黄酮浓度单位为μm，萝卜硫素2.0μm为阳性对照。

图2不同时间异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮对nrf2蛋白水平免疫印迹分析图；

图2表明异黄酮能够延长nrf2蛋白半衰期，图中异黄酮浓度为6.25μm。

图3不同浓度异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的免疫印迹分析图；

图3表明异黄酮能够上调nrf2和其下游抗氧化γgcs和ii相解毒酶蛋白nqo1蛋白水平，图中的异黄酮浓度单位为μm。

图4异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮对细胞谷胱甘肽含量柱状图；

其中，图4a为不同浓度异黄酮对细胞内谷胱甘肽水平的影响测试，图4b为6.25μm异黄酮与细胞作用不同时间后，对其谷胱甘肽的影响测试。表明异黄酮能够剂量时间依赖的增加人支气管上皮beas-2b细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平，图中萝卜硫素2.5μm为阳性对照，异黄酮浓度单位为μm；时间单位为h。

图5异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮对细胞内源性活性氧影响的荧光图；

图5表明异黄酮能够抑制过量内源性活性氧的产生，图中异黄酮浓度为6.25μm。

图6细胞毒性试验的检测异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮对细胞存活量影响的柱状图；

图6表明异黄酮能够抑制砷诱导的细胞毒性，图6a为不同浓度异黄酮对10μm砷诱导细胞毒性的保护作用，图6b为6.25μm异黄酮对不同浓度砷诱导细胞毒性的保护作用。

图7流式细胞调亡图；

图7表明异黄酮能够抑制砷诱导的细胞凋亡，异黄酮浓度为6.25μm，砷的浓度为10μm。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术对异黄酮活性检测不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了异黄酮在制备氧化应激诱发疾病药物中的应用。

本发明的一种典型实施方式中，提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的分离方法，将红车轴草投入乙醇溶液中加热回流提取，浓缩滤液得浸膏，向浸膏中加水混悬溶解后，依次加入石油醚和乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯部分通过硅胶柱层析梯度洗脱后得到无色结晶，即5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

该5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的化学式为：

优选的实施方案中，该分离方法的具体步骤如下：

(1)将红车轴草投入乙醇溶液中加热回流提取，合并滤液后浓缩得到乙醇浸膏；

(2)向步骤(1)得到的乙醇浸膏中加入适量水溶解，加入石油醚萃取后再加入乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取部位；

(3)向上述乙酸乙酯萃取部位加入硅胶搅拌，然后经硅胶柱层析梯度洗脱分离，硅胶柱层析的体系为二氯甲烷-甲醇系统，洗脱后得到九个部分，根据出峰时间记为fr.1-fr.9；

(4)将步骤(3)中得到的fr4进一步经硅胶柱层析梯度洗脱分离，硅胶柱层析的体系为二氯甲烷-甲醇系统，梯度洗脱后得到无色结晶，即5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

优选的实施方案中，步骤(1)的具体操作为：将红车轴草投入8倍量的75％的乙醇溶液中加热回流三次，每次1.5h。

具体的实施例中，红车轴草2kg，以8倍量75％乙醇为溶剂，加热回流提取3次，每次1.5小时，过滤合并滤液，浓缩得乙醇浸膏200g。

优选的实施方案中，步骤(2)的具体操作为：向乙醇浸膏中加水溶解，加入石油醚萃取三次后，弃去石油醚部位，再加入乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，得到乙酸乙酯部位。

具体的实施例中，萃取后得到乙酸乙酯部位45g。

优选的，步骤(3)中采用硅胶柱层析进行梯度洗脱，所用体系为二氯甲烷-甲醇，梯度洗脱程序为：二氯甲烷-甲醇系统体积比为100:0、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、60:40、50:50、0:100，洗脱后得到九个部分，记为fr.1-fr.9。

优选的实施方案中，步骤(4)中采用梯度洗脱程序进行洗脱，具体程序为：二氯甲烷-甲醇系统体积比为93:7、88:12、80:20，在88:12体积比下的馏分有结晶析出，为5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

本发明的又一种典型实施方式中，提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物中的应用。

优选的实施方案中，上述氧化应激诱发疾病为慢性阻塞性肺疾病、呼吸道炎症、皮肤病变、糖尿病、神经退行性疾病或肿瘤疾病。

优选的实施方案中，在上述应用中，5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的治疗浓度为6.25～12.5μm，具体的实施例中，为6.25μm。

优选的实施方案中，上述应用中，5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮为胶囊剂、片剂、散剂、凝胶剂、颗粒剂、注射剂、口服液、酒剂、丸剂、合剂或酊剂。

本发明的又一种典型实施方式中，提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮片剂的制备方法，将异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮、淀粉及糊精混合后过筛，再加入羧甲基纤维素钠制粒，然后加入硬脂酸镁混合后压片即得片剂；优选的实施方案中，其中异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮、淀粉及糊精质量比为1-2:2-3:2-3。

本发明的又一种典型实施方式中，提供一种5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮凝胶剂的制备方法，将卡波姆和聚山梨醇加入至水中混均，再加入异黄酮混合均匀即得凝胶剂；优选的实施方式中，该凝胶剂中异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮、卡波姆和聚山梨醇的质量比为2-3:3-4:1-2。

本发明的又一种典型实施方式中，提供一种具有抗氧化功效的化妆品，成份为5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮及一般化妆品原料。

优选的实施方式中，上述化妆品可以为面膜、护肤霜、护肤膏、护肤水、护肤粉或护肤凝胶。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

实施例1：异黄酮的分离和结构确证

红车轴草2kg，以8倍量75％乙醇为溶剂，加热回流提取3次，。每次1.5小时，过滤合并滤液，浓缩得乙醇浸膏200g；加水混悬溶解，依次采用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别萃取3次，得乙酸乙酯部位45克。将乙酸乙酯部位，加硅胶适量拌样，硅胶柱层析，采用二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，合并的9个部分，依据出峰时间记为fr.1-fr.9。fr4采用硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇95:5至80:20梯度洗脱，有无色结晶析出，记为fr4a。采用nmr法进行了结构确证，其1h-nmr谱数据如下：

1h-nmr(cdcl3)12.90(1h,s,5-oh),7.89(1h,s,h-2),4.49(2h,d,j＝8.2hz,h-2’,6’),7.01(2h,d,j＝8.7hz,h-3’,5’),6.43(1h,d,j＝2.1hz,h-6),6.42(1h,d,j＝2.2hz,h-8),3.89(3h,s,7-och3)。

经解析，确证其结构为5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮。

实施例2：异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮的nqo1诱导活性评价

(1)小鼠肝癌细胞hepa1c1c细胞系的培养

小鼠肝癌细胞hepa1c1c细胞系购自美国模式培养物集存库(atcc)，采用含10％胎牛血清(fbs)的mem培养基，置于37℃，5％co2培养箱中培养。

(2)nqo1诱导活性试验

将hepa1c1c细胞接种于96孔板上，细胞贴壁后加入不同浓度的异黄酮(实施例1确证)，处理24小时，采用0.8％洋地黄皂苷溶液裂解细胞，加入检测液(1.0ml0.5m三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)，15mg牛血清白蛋白，6mgmtt，150μl吐温-20，150μl150mmd-葡萄糖-6-磷酸，15μl7.5mm黄素腺嘌呤二核苷酸，27μl50mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20μl50mm甲萘醌)，放置3分钟，于630nm测定发光强度。

结果：如图1所示，异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮能够激活hepa1c1c7细胞中nqo1活性，其最大诱导活性为4倍(50μm)，阳性对照药物萝卜硫素(2.0μm)是空白对照组的2.9倍。上述结果表明，异黄酮能够激活ii相脱毒酶，对人体细胞具有保护作用。

实施例3：异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮增加nrf2蛋白稳定性

(1)人正常表皮beas-2b细胞的培养

人正常肺支气管上皮beas-2b细胞购自美国模式培养物集存库(atcc)，采用1640培养基，并向其中加入10％胎牛血清(fbs)，5％谷氨酰胺，置于37℃，5％co2培养箱中培养。

(2)蛋白质印迹分析检测nrf2蛋白半衰期

将beas-2b细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，加入异黄酮8h，然后加入放线菌酮，计时，分别在0、10、20、30、40分钟收取蛋白，进行蛋白质印迹分析检测，采用imagej软件进行量化。

结果：如图2所示，空白组beas-2b细胞nrf2蛋白半衰期为14.7分钟，经异黄酮处理8h后，nrf2蛋白半衰期延长至27.6分钟，表明异黄酮能够延长nrf2蛋白半衰期。

实施例4：异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮能够上调nrf2、γgcs和nqo1蛋白水平

方法：蛋白质印迹分析(westernblot)检测细胞中蛋白水平的变化

将beas-2b细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，加入不同浓度的待测化合物处理16h，pbs洗涤2次，加入细胞裂解液(50μg/ml抑肽酶，0.5mm苯甲基磺酰氟，1mm正钒酸钠，10mm氟化钠，10mmβ-磷酸甘油)，收集蛋白并采用bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白(100μg)上样，sds-page分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经tbs配制5％的脱脂奶粉溶液室温封闭1h后，分别与各待测蛋白抗体4℃孵育过夜。经tbs洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h后，用增强型ecl化学发光进行蛋白分析。

结果：如图3所示，细胞经异黄酮处理16h后，nrf2及其下游抗氧化和ii相解毒酶蛋白nqo1和γgcs蛋白水平呈现剂量依赖性增加，keap1蛋白水平无变化，证实该化合物能够在蛋白水平上激活nrf2信号通路。

实施例5：异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮能够增加细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平

方法：细胞内谷胱甘肽含量的测定

将beas-2b细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，同一时间加入不同浓度的异黄酮(实施例1确证)处理24小时，或不同时间加入6.25μm异黄酮(实施例1确证)处理细胞，pbs洗涤2次，加入0.5ml50mm磷酸钠和1mmedta缓冲液收细胞，超声1min，10000g离心15分钟，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，412nm测定吸光度并计算谷胱甘肽含量。

结果：如图4所示，异黄酮能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力。并在24h时，对其诱导达到峰值。

实施例6：异黄酮能降低砷诱导的人支气管上皮beas-2b细胞中过量内源性活性氧的水平

将beas-2b细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到30％-40％后，加入异黄酮处理8h，然后与5μmas共作用10h，弃去培养液后加入dcfh-da(10μm)孵育30min，pbs洗3次，采用荧光显微镜观察并拍照。

结果：如图5所示，异黄酮能够显著降低砷诱导的过量内源性活性氧的水平，抑制细胞氧化应激。

实施例7：异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮对砷诱导的人支气管上皮beas-2b细胞损伤的保护作用

方法：mtt法测定异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮对砷诱导的细胞毒性的保护作用

将beas-2b细胞接种于96孔板上，细胞贴壁后，采用待测浓度异黄酮预处理细胞8小时，加入不同浓度的砷和待测浓度异黄酮(实施例1确证)处理24小时，或者加入mtt3小时后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。

结果：如图6a所示，采用异黄酮预处理细胞8小时，能够显著抑制10μm砷诱发的细胞毒性，增加细胞生存率，其中6.25μm浓度异黄酮活性最佳。如图6b所示，采用6.25μm浓度异黄酮作为保护药物，能够显著抑制5、10、20μm的砷诱发的细胞毒性，增加细胞生存率。结果证明，异黄酮能够抑制致癌物砷诱导的毒性。

实施例8：异黄酮5-羟基-4，7’-二甲氧基异黄酮能够抑制砷诱导的细胞调亡

方法：流式细胞技术测定异黄酮对砷诱导的细胞凋亡的保护作用

将beas-2b细胞接种于35mm培养皿，贴壁后加入5μm砷或6.25μm异黄酮处理12h，吸取含药培养液至15ml离心管，pbs清洗1次，用无血清胰酶消化细胞，将培养液、pbs清洗液和胰酶消化液一起并入15ml离心管，离心(3000rmp，2min)后pbs洗1次，收集细胞并加入100ul1xbindingbuffer使其悬浮，加入5μlpi，5μlannexinv-fitc，于2-8℃避光孵育15min，加入300ul1xbindingbuffer悬浮细胞后，使用流式技术检测细胞凋亡。

结果：如图7所示，采用砷或异黄酮共处理12小时，能够显著抑制砷诱导的细胞凋亡。

实施例9：片剂的制备

异黄酮1g，加入淀粉1.5g、糊精1.5g，过筛，加入羧甲基纤维素钠适量，制粒。加入硬脂酸镁适量，混匀，压片，即得。

实施例10：凝胶剂的制备

卡波姆3克、1g聚山梨酯、100ml水混合均匀，加入异黄酮2g，充分混匀，并分装，即得。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。