本发明属于中药活性成分提取方法
技术领域：
，涉及到提取二氢杨梅素的方法，特别是藤茶中提取二氢杨梅素的方法及应用。
背景技术：
藤茶，学名为显齿蛇葡萄【ampelopsisgrossedentata(hand-mazz)w.t.wang】，是葡萄科(vitaceaemichx)蛇葡萄属(ampelopsis)的一种野生木质落叶藤本植物，俗称山甜茶、甘露茶、白毛猴、白茶、白茶饼等。文献报道藤茶及其提取物有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎镇痛、广谱抗菌、降血糖、降血脂、保肝等作用，药理实验证明其功效主要是由黄酮类化合物尤其是二氢杨梅树皮素(dihydromyricetin)和杨梅树皮素(myricetin)所致。化学成分分析表明，藤茶中黄酮总含量高达40％左右，其中二氢杨梅素的含量达到20％以上，所以从藤茶中开发二氢杨梅素的技术研究具有重要的意义和应用前景。藤茶中的二氢杨梅素属多羟基黄酮醇类化合物，具极性，易溶于热水、乙醇等，提取方法主要以传统溶剂浸提法为主，文献报道的方法有以下几种：(1)采用有机溶剂提取，如甲醇、乙醇、丙酮等作为溶剂，其中以乙醇提取为主，有冷浸或热回流法；(2)热水提取；(3)碱液提取；(4)酶解提取；(5)超临界流体萃取。在溶剂浸提的基础上，辅以超声波、微波手段，以强化提取效果。周天达和何桂霞等将藤茶粗粉末以石油醚脱去脂溶性色素，再用95％乙醇回流提取，收集乙醇提取液，经浓缩除醇、分离纯化得到二氢杨梅素和杨梅素。袁阿兴等将显齿葡萄地上部分粉碎成粗粉，热水煎煮3次，2h/次，趁热过滤，冷却、沉淀，收集沉淀部分得到双氢黄酮类。韦星船等以微波装置和压力蒸汽灭菌器为提取装置，稀碱水为溶剂提取藤茶中二氢杨梅素，确定提取条件为高温高压时间45min，料液比为1：25，微波温度为95℃，微波功率为600w。陈雁梅等采用酶法提取藤茶废弃物茎中的二氢杨梅素，确定酶法提取工艺条件上温度为45℃，ph值为4.46，酶添加量为2.0％，料液质量体积比为1：20。沈露采用co2超临界流体萃取技术对藤茶中二氢杨梅素进行提取，提取条件为萃取压力25mpa，萃取温度为50℃，萃取时间为1.5h，co2流量控制在20l/h。传统溶剂浸提法提取二氢杨梅素普遍存在提取溶剂用量大、提取周期长、提取得率低等问题。碱液提取法及酶解方法提取过程中会用到酸碱溶液，后序处理较复杂，不符合人体健康需求及对企业的环保要求。超临界流体萃取技术目前国内主要用于中试及小批量生产，应用于大规模工业化生产还有很大难度。较为先进的提取方法是微波动态循环阶段连续逆流提取技术，它结合了微波辅助提取中药有效成分的优势和连续逆流提取的特点，采用具精密控温、控制加热功率和时间的mars5微波装置(美国)，效果优于微波静态间歇提取，但此技术所需设备及操作程序较复杂。技术实现要素：本发明为了克服现有技术的缺陷，设计了藤茶中提取二氢杨梅素的方法及应用，将超微粉碎预处理技术和动态循环提取技术相结合，工艺简单，可以缩短提取周期，提高提取的得率。该方法适应大规模工业化生产线设备，可以减少提取溶剂用量，对环境无污染，易于工业化操作应用。本发明所采取的具体技术方案是：藤茶中提取二氢杨梅素的方法，关键在于，包括以下步骤：(1)选取藤茶原料，经干燥、粉碎，制得20-60目细度的藤茶粗粉；(2)将藤茶粗粉进行超微粉碎，得到粒径≤30μm的藤茶超微粉；(3)将藤茶超微粉进行首次动态循环提取，得到首次提取液；(4)在首次提取液中加入活性炭进行脱色除杂，脱色除杂后的首次提取液为吸附液；(5)将吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(6)将二氢杨梅素粗提物进行二次动态循环提取，提取溶剂为丙酮，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶后得到二氢杨梅素。在步骤(3)中，首次动态循环提取是在2-6根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，任选一个提取柱作为起始柱，加入提取溶剂，启动循环泵，经动态循环提取后放出提取溶液进入下一根提取柱并在该提取柱中加入提取溶剂，然后启动循环泵，经过2-5根提取柱提取后，收集得到首次提取液。在步骤(3)中，首次动态循环提取的提取温度为80-100℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为(1：5)-(1：20)，每根提取柱循环提取时间为20-60min。在步骤(3)中，首次动态循环提取的提取温度为85-95℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为(1：10)-(1：15)，每根提取柱循环提取时间为30-40min。在步骤(3)中，提取溶剂为水，或者是乙醇，或者是乙醇和水的混合溶液。在步骤(3)中，采用加热保温、微波辅助、或者是超声辅助方式进行提取。在步骤(4)中，活性炭的加入量是首次提取液重量的0.5-2％，活性炭与首次提取液的吸附接触时间为15-120min。在步骤(4)中，活性炭的加入量是提取液重量的0.8-1.2％，活性炭与首次提取液的吸附接触时间为30-60min。在步骤(6)中，二次动态循环提取的提取次数为一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为(1：3)-(1：5)，提取温度为20-40℃，提取时间为20-60min，重结晶次数为2-4次。用藤茶中提取二氢杨梅素的方法制备的二氢杨梅素在具有降血糖功能的食品、保健食品或药品制备中的应用。本发明的有益效果是：本发明相对于现有藤茶中二氢杨梅素的提取技术优势在于，(1)创造性地将超微粉碎技术用于藤茶中二氢杨梅素提取的原料预处理阶段，利用超强机械力破坏细胞壁组织，使得原本存在于层层细胞内的二氢杨梅素在提取时直接暴露于溶剂中，大大降低了二氢杨梅素外扩散的传质阻力，显著地提高了提取得率且缩短了提取周期；(2)将动态循环提取技术用于藤茶中二氢杨梅素的提取过程，提供了动态循环工艺提取装置及参数，工艺简单，可以减少溶剂用量，缩短提取周期，提高提取得率；(3)创造性地使用动态循环提取技术将二氢杨梅素粗提物中的二氢杨梅素和杨梅素分离，可以减少溶剂使用量，提高提取效率，提高二氢杨梅素的纯度；(4)创新结合使用超微粉碎预处理技术和动态循环提取技术，每个步骤相互协同，共同起到提高提取得率、缩短提取周期、减少溶剂用量、节能环保等作用，该方法适应大规模工业化生产线设备，对环境无污染，易于工业化操作应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作详细说明：本发明中的藤茶原料为藤茶叶，或者是藤茶茎，或者是藤茶叶和茎的混合物料。提取时，溶剂的渗入和二氢杨梅素的溶出需要穿过表皮、纤维层等多层细胞，而细胞壁结构致密，是形成传质阻力的主要因素，致使现有提取方法的提取得率和提取效率较低。超微粉碎是以细胞破壁为目的的粉碎技术，在中草药的研究和制备领域主要应用于制剂的加工，以提高药物的生物利用度。本发明创造性地将超微粉碎技术用于藤茶中二氢杨梅素提取的原料预处理阶段，显著地提高了提取得率且缩短了提取周期。超微粉碎优选使用干法超微粉碎设备，如气流粉碎器、振动超细粉碎机等。首次动态循环提取优选是在2-5根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，优选经过3-4根提取柱提取后，收集得到首次提取液。首次动态循环提取时，由于动态循环提取效率较高，所以料液比即藤茶超微粉与提取溶剂的质量比优选为(1：10)-(1：15)；由于加热过程中，二氢杨梅素可能随着加热时间的延长而发生氧化反应，所以每根提取柱循环提取时间优选为30-40min；为了减少有机溶剂残留和工业化生产，提取溶剂优选为水。本发明采用动态循环提取方法提取藤茶中的二氢杨梅素，通过强制溶媒循环，使固液两相在提取过程中处于相对运动状态，通过浓度差使藤茶中的二氢杨梅素快速转移到提取溶剂中，从而加速浸出过程，提高浸出得率，缩短生产周期。该提取原理为已知，相应的生产设备已有报道，但现有技术中不同的动态循环提取装置及不同的动态循环提取方式对天然物质的提取率有很大的影响，而且缺乏藤茶中二氢杨梅素动态循环提取相关工艺参数或效果的具体研究。本发明通过系统研究，对藤茶中二氢杨梅素动态循环提取装置及提取方法中关键的工艺参数，包括动态循环提取的提取溶剂、提取温度、料液比、每根提取柱循环提取时间等进行了考察和优化，获得了具有可操作性的工艺控制参数。在首次提取液中加入活性炭进行活性炭吸附，是为了确保除去首次提取液中的色素和杂质。因为二氢杨梅素在热水和冷水中的溶解度有显著差别，所以将吸附液趁热过滤，利用常规干燥方法进行干燥即可。二氢杨梅素粗提物主要包括二氢杨梅素和部分杨梅素等其他物质，由于二氢杨梅素易溶于丙酮、热乙醇及热水，而杨梅素溶于热乙醇、热水、甲醇，不溶于丙酮，所以根据二氢杨梅素和杨梅素在不同溶剂中溶解度的差异，提取溶剂选为丙酮，使得二氢杨梅素与杨梅素分离，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶后得到二氢杨梅素；丙酮提取分离二氢杨梅素与杨梅素的传统方法是采用丙酮回流提取法，鉴于回流提取法溶剂用量较大，提取时间较长，设备较复杂，不适于大规模生产，所以本发明采用动态循环提取方法，二次动态循环提取的提取次数为一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为(1：3)-(1：5)，提取温度为20-40℃，提取时间为20-60min，重结晶次数为2-4次，为了保证二氢杨梅素的纯度，同时缩短生产周期，重结晶次数优选为2-3次。利用动态循环提取方法将二氢杨梅素与杨梅素分离，可以减少提取溶剂使用量，提高提取的得率和纯度。实施例1(1)选取藤茶叶，经自然晾干法干燥，植物粉碎机粉碎，制得20目细度的藤茶粗粉；(2)将步骤(1)所得藤茶粗粉采用气流粉碎器进行超微粉碎，得到粒径≤30μm的藤茶超微粉；(3)将步骤(2)所得藤茶超微粉进行首次动态循环提取，首次动态循环提取是在3根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，任选一个提取柱作为起始柱，加入提取溶剂，启动循环泵，经动态循环提取后放出提取溶液进入下一根提取柱并在该提取柱中加入提取溶剂，然后启动循环泵，经过2根提取柱提取后，收集得到首次提取液；提取溶剂为水，提取温度为80℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为1：20，每根提取柱循环提取时间为30min；(4)对步骤(3)得到的首次提取液进行活性炭吸附，活性炭加入量是首次提取液重量的0.5％，活性炭与首次提取液吸附接触时间为120min，得到吸附液；(5)将步骤(4)得到的吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行减压干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(6)将步骤(5)得到的二氢杨梅素粗提物进行二次动态循环提取，提取溶剂为丙酮，提取一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为1：3，提取温度为20℃，提取时间为20min，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶2次后，得到二氢杨梅素，所得二氢杨梅素的得率为16.3％，纯度为84.2％。对比例1与实施例1的不同之处在于：去除步骤(2)，其余制备方法同实施例1。对比例2与实施例1的不同之处在于：步骤(3)中对藤茶超微粉进行常规溶液浸提提取，其余制备方法同实施例1。对比例3与实施例1的不同之处在于：去除步骤(4)，其余制备方法同实施例1。对比例4与实施例1的不同之处在于：将二氢杨梅素粗提物进行丙酮回流提取，其余制备方法同实施例1。对比例5(1)选取藤茶叶，经自然晾干法干燥，植物粉碎机粉碎，制得20目细度的藤茶粗粉；(2)将步骤(1)所得藤茶粗粉进行常规溶剂浸提，提取溶剂为水，提取温度为80℃，料液比(即藤茶粗粉与提取溶剂的重量之比)为1：20，提取时间为30min，提取次数为2次，得到提取液；(3)对步骤(2)得到的提取液进行活性炭吸附，活性炭加入量是提取液重量的0.5％，活性炭与提取液吸附接触时间为120min，得到吸附液；(4)将步骤(3)得到的吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行减压干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(5)将步骤(4)得到的二氢杨梅素粗提物进行丙酮回流提取，提取溶剂为丙酮，提取1次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为1：3，提取温度为20℃，提取时间为20min，将提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶2次后，得到二氢杨梅素。实施例1及上述五个对比例制得的二氢杨梅素的得率、纯度如下面的表1所示：表1实施例与对比例藤茶中二氢杨梅素提取方法对比方法二氢杨梅素的得率(％)二氢杨梅素的纯度(％)实施例116.384.2对比例110.682.7对比例28.579.2对比例313.461.1对比例411.362.5对比例54.661.8将实施例1和对比例1的数据进行对比可知，将超微粉碎技术用于藤茶中二氢杨梅素提取的原料预处理阶段，可以显著提高二氢杨梅素的得率和纯度，得率可以提高53.77％，纯度可以提高1.81％。将实施例1和对比例2的数据进行对比可知，利用动态循环提取方式代替常规溶液浸提提取方式对藤茶超微粉进行提取，可以显著提高二氢杨梅素的得率和纯度，得率可以提高91.76％，纯度可以提高6.31％。将实施例1和对比例3的数据进行对比可知，对首次提取液进行活性炭吸附，可以显著提高二氢杨梅素的得率和纯度，得率可以提高21.64％，纯度可以提高37.81％。将实施例1和对比例4的数据进行对比可知，利用动态循环提取方式代替回流提取方式对二氢杨梅素粗提物进行提取，可以显著提高二氢杨梅素的得率和纯度，得率可以提高44.25％，纯度可以提高34.72％。将实施例1和对比例5的数据进行对比可知，本发明中将超微粉碎技术用于藤茶中二氢杨梅素提取的原料预处理阶段、利用动态循环提取方式代替常规溶液浸提提取方式对藤茶超微粉进行提取、同时利用动态循环提取方式代替回流提取方式对二氢杨梅素粗提物进行提取，三者相结合可以显著提高二氢杨梅素的得率和纯度，得率可以提高254.35％，纯度可以提高36.25％。实施例2(1)选取藤茶茎，经60℃恒温干燥箱干燥，植物粉碎机粉碎，制得40目细度的藤茶粗粉；(2)将步骤(1)所得藤茶粗粉采用流化床气流粉碎机进行超微粉碎，得到粒径≤30μm的藤茶超微粉；(3)将步骤(2)所得藤茶超微粉进行首次动态循环提取，首次动态循环提取是在4根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，任选一个提取柱作为起始柱，加入提取溶剂，启动循环泵，经动态循环提取后放出提取溶液进入下一根提取柱并在该提取柱中加入提取溶剂，然后启动循环泵，经过3根提取柱提取后，收集得到首次提取液；提取溶剂为质量分数是30％的乙醇水溶液，提取温度为85℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为1：10，每根提取柱循环提取时间为40min；(4)对步骤(3)得到的首次提取液进行活性炭吸附，活性炭加入量是首次提取液重量的0.8％，活性炭与首次提取液吸附接触时间为90min，得到吸附液；(5)将步骤(4)得到的吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行减压干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(6)将步骤(5)得到的二氢杨梅素粗提物进行二次动态循环提取，提取溶剂为丙酮，提取一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为1：4，提取温度为25℃，提取时间为30min，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶3次后，得到二氢杨梅素，所得二氢杨梅素的得率为13.7％、纯度为86.5％。实施例3(1)选取藤茶叶和茎的混合物料，经80℃恒温干燥箱干燥，植物粉碎机粉碎，制得60目细度的藤茶粗粉；(2)将步骤(1)所得藤茶粗粉采用滚动球磨机进行超微粉碎，得到粒径≤30μm的藤茶超微粉；(3)将步骤(2)所得藤茶超微粉进行首次动态循环提取，首次动态循环提取是在5根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，任选一个提取柱作为起始柱，加入提取溶剂，启动循环泵，经动态循环提取后放出提取溶液进入下一根提取柱并在该提取柱中加入提取溶剂，然后启动循环泵，经过4根提取柱提取后，收集得到首次提取液；提取溶剂为质量分数是50％的乙醇水溶液，提取温度为90℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为1：15，每根提取柱循环提取时间为45min；(4)对步骤(3)得到的首次提取液进行活性炭吸附，活性炭加入量是首次提取液重量的1％，活性炭与首次提取液吸附接触时间为60min，得到吸附液；(5)将步骤(4)得到的吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行减压干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(6)将步骤(5)得到的二氢杨梅素粗提物进行二次动态循环提取，提取溶剂为丙酮，提取一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为1：4，提取温度为30℃，提取时间为40min，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶4次后，得到二氢杨梅素，所得二氢杨梅素的得率为10.6％、纯度为92.8％。实施例4(1)选取藤茶叶，经100℃恒温干燥箱干燥，植物粉碎机粉碎，制得20目细度的藤茶粗粉；(2)将步骤(1)所得藤茶粗粉采用超音速气流超微粉碎机进行超微粉碎，得到粒径≤30μm的藤茶超微粉；(3)将步骤(2)所得藤茶超微粉进行首次动态循环提取，首次动态循环提取是在6根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，任选一个提取柱作为起始柱，加入提取溶剂，启动循环泵，经动态循环提取后放出提取溶液进入下一根提取柱并在该提取柱中加入提取溶剂，然后启动循环泵，经过5根提取柱提取后，收集得到首次提取液；采用超声辅助提取，超声功率为400w，提取溶剂为水，提取温度为80℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为1：20，每根提取柱循环提取时间为25min；(4)对步骤(3)得到的首次提取液进行活性炭吸附，活性炭加入量是首次提取液重量的1.2％，活性炭与首次提取液吸附接触时间为40min，得到吸附液；(5)将步骤(4)得到的吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行减压干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(6)将步骤(5)得到的二氢杨梅素粗提物进行二次动态循环提取，提取溶剂为丙酮，提取一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为1：4，提取温度为35℃，提取时间为50min，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶4次后，得到二氢杨梅素，所得二氢杨梅素的得率为12.2％、纯度为94.4％。实施例5(1)选取藤茶叶，经70℃恒温干燥箱干燥，植物粉碎机粉碎，制得40目细度的藤茶粗粉；(2)将步骤(1)所得藤茶粗粉采用振动磨进行超微粉碎，得到粒径≤30μm的藤茶超微粉；(3)将步骤(2)所得藤茶超微粉进行首次动态循环提取，首次动态循环提取是在4根提取柱串联组合成的提取系统中进行的，任选一个提取柱作为起始柱，加入提取溶剂，启动循环泵，经动态循环提取后放出提取溶液进入下一根提取柱并在该提取柱中加入提取溶剂，然后启动循环泵，经过3根提取柱提取后，收集得到首次提取液；采用微波辅助提取，微波功率为500w，微波时间为5min，提取溶剂为水，提取温度为85℃，藤茶超微粉与提取溶剂的质量比为1：10，每根提取柱循环提取时间为35min；(4)对步骤(3)得到的首次提取液进行活性炭吸附，活性炭加入量是首次提取液重量的1.5％，活性炭与首次提取液吸附接触时间为20min，得到吸附液；(5)将步骤(4)得到的吸附液趁热过滤，收集滤液，待滤液自然放置降到室温后，再冷却至0-4℃，结晶，收集沉淀，进行减压干燥，得到二氢杨梅素粗提物；(6)将步骤(5)得到的二氢杨梅素粗提物进行二次动态循环提取，提取溶剂为丙酮，提取一次，二氢杨梅素粗提物与丙酮的质量比为1：5，提取温度为40℃，提取时间为60min，将得到的二次提取液经浓缩、加水沉淀、重结晶3次后，得到二氢杨梅素，所得二氢杨梅素的得率为11.7％、纯度为90.3％。实施例6用本发明的方法制备的二氢杨梅素在保健袋泡茶中的应用：取实施例1中所得二氢杨梅素提取物，与绿茶按照质量比为1：10的比例送入混合机混合均匀，装入滤纸袋，装盒，得到降糖保健茶。实施例7用本发明的方法制备的二氢杨梅素在制备降糖药物中的应用：取实施例2所得二氢杨梅素提取物200g，甘露醇200g，糊精200g，山梨醇200g；将上述原辅料粉碎，过80目筛网，混合均匀；用质量分数是50％的乙醇制粒，60℃干燥，整粒，分装，得到降糖药物。当前第1页12