乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用的制作方法

本发明涉及乳酸乳球菌mg1363的制备方法及其在细菌性阴道炎中的应用，属于生物制药领域。

背景技术：

趋化因子是一类对白细胞和干细胞具有定向趋化募集作用的小分子多肽类物质，它们的结构及功能相似，绝大多数在氨基酸序列上有4个保守的半胱氨酸，且根据其n端半胱氨酸的数量及间距的不同分为c-、cxc-、cc-及cx3c-4类趋化因子。趋化因子cxcl12又称基质细胞衍生因子-1(sdf-1)，它有两种形式，sdf-1α/cxcl12a和sdf-1β/cxcl12b。cxcr4是趋化因子cxcll2的特异性受体，属于g蛋白耦联的跨膜受体家族，与cxcll2有高度的亲和力，它广泛表达在血液，免疫和中枢神经系统细胞。研究表明cxcl12/cxcr4效应轴主要参与缺血缺氧及损伤组织的修复，人类子宫内膜中cxcl12功能的研究表明：cxcl12可能在内膜增殖、胚胎着床中发挥重要作用，它们不仅能趋化白细胞以及修复细胞募集到创面，而且还能激活这些细胞，并增强它们的功能。因此我们设想可否通过cxcl12能够参与局部炎症反应和组织修复的性质来治疗细菌性阴道感染。但是，cxcl12在人体血液中极易被二肽氨肽酶iv(dppiv)降解，且在严重组织损伤修复时产生的内源性cxcll2水平不能满足组织修复的需要，因此有必要引入外源性cxcll2。

本发明构建了pmg36e-cxcl12重组表达载体，采用乳酸乳球菌mg1363作为表达菌株。乳酸乳球菌属于公认的益生菌，对人体有良好的益生作用，同时乳酸菌良好的耐酸、产酸特性，为重组菌株在阴道中发挥作用提供了基本条件，并且乳酸乳球菌在人体阴道中可以实现cxcl12持续不断地表达，乳酸菌产酸及阴道的酸性内环境均可抑制dppiv的生物活性，从而提高cxcl12的生物利用度以达到治疗细菌性阴道感染功效。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种分泌表达趋化因子cxcl12的乳酸乳球菌mg1363的制备方法及其在治疗细菌性阴道感染中的应用，建立了一种cxcl12乳酸乳球菌表达系统，通过乳酸乳球菌在阴道内持续分泌表达cxcl12，参与局部炎症反应和组织修复，从而实现对细菌性阴道感染的治疗作用；

本发明是通过以下技术步骤实现的：

乳酸乳球菌mg1363的构建,由以下步骤组成：

(1)pmg36e-cxcl12重组质粒构建:psti-spusp45-cxcl12-hindiii全序列化学合成获得puc57-cxcl12重组质粒；

(2)构建pmg36e-cxcl12重组质粒：

a采用omega质粒小提试剂盒，提取pmg36e，puc57-cxcl12质粒；

b酶切：pmg36e，puc57-cxcl12酶切体系如下，总体系为25μl，37℃酶切4h；

c配制2％琼脂糖凝胶电泳，110v电泳45min；在276bp和3600bp左右切胶回收；

d酶连：酶连体系如下，总体系10μl，fragment:vector＝5：1和10：1，10℃过夜；

e：转化由以下步骤组成:

a:从-80℃冰箱中取200μlmc1061感受态细胞悬液，冰上解冻；

b:加入2μl质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μl，轻轻摇匀，冰上放置30min后；

c:42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；

d:向管中加入800μllb液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min。弃上清800μl，留200μl菌液，混匀；

e:将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含300ng/μl红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；

f:测序；

g:测序成功后，采用omega质粒小提试剂盒提取重组质粒pmg36e-cxcl12，保存备用。

将所制备的pmg36e-cxcl12通过电转化为乳酸乳球菌mg1363，转化过程由以下步骤组成：

a乳酸菌感受态制备：

a：取-80℃冻存的乳酸乳球菌mg1363接种于5ml含有5％葡萄糖的m17液体培养基中，30℃过夜培养；

b:将获得菌液按照1％接种于含有2.5％gly和5％葡萄糖的m17液体培养基中，30℃静置培养至菌体od600值为0.3-0.4，收集备用；

c:将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；

d:沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；

e:最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后即可使用；

b乳酸乳球菌mg1363电转化：

a:取2μl重组质粒，浓度不低于150ng/μl，与上述方法制备的50μl冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800v，200ω，25μf；

b:电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μl的含5％葡萄糖的m17液体培养基中，30℃培养2h，取100μl转化后产物涂布在含有红霉素抗性的含5％葡萄糖的m17平板上，30℃静置培养24-72h，筛选阳性克隆子；

所制备的pmg36e-cxcl12采用western检测其在乳酸乳球菌中分泌表达，具体由以下步骤组成：

a电泳,具体步骤为：

a:配制12％sds-page凝胶；

b:样品处理

将含有pmg36e-cxcl12的乳酸乳球菌mg1363培养36h-48h，收集上清和沉淀；将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×sds-page蛋白上样缓冲液，终浓度为1×蛋白样品，100℃或沸水浴加热10min，以充分变性蛋白；

c:上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到sds-page胶加样孔内；电泳时电泳液使用碧云天生产的sds-page电泳液-p0014a/p0014b；电泳参数为：40v电泳60min，80v电泳90min；

bwestern检测，具体步骤为：

a：采用pvdf膜转膜；条件为100v，45min；

b:转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的western洗涤液中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液；

c：加入western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90min；

d:兔源cxcl12多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，tbst洗涤三次，每次10min；

e:辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg按照1:1000采用1％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的1％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，tbst洗涤三次，每次10min；

f:显色液a液和b液各250μl1:1避光混合，现配现用，曝光。

通过阴道栓塞给药的方式，使得酸乳球菌mg1363持续表达趋化因子cxcl12，以实现对细菌性阴道炎的缓解和治疗作用。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过构建pmg36e-cxcl12组成型表达载体，在添加乳酸乳球菌穿膜肽spusp45后，采用电转的方法将重组质粒转入乳酸乳球菌mg1363实现cxcl12的分泌表达；

(2)乳酸菌良好的耐酸、产酸特性，为重组菌株在阴道中发挥作用提供了基础条件；

(3)乳酸乳球菌在人体阴道中可以实现cxcl12持续不断地表达，并且乳酸菌产酸及阴道的酸性内环境均可抑制dppiv的生物活性，从而提高cxcl12的生物利用度，因此足够的cxcl12可参与局部炎症反应和组织修复以达到治疗细菌性阴道感染功效。

附图说明

图1为不同药物下大鼠子宫组织he染色图。

具体实施方式

实施例1

实施例详细描述：所述药效通过细菌性阴道炎大鼠模型进行评估

一、大鼠阴道炎模型的建立

(1)实验分组为阴性对照组、模型组、甲硝唑治疗、乳酸乳球菌工程菌株治疗组、卷曲乳杆菌工程菌株治疗组，每组5只；

(2)抗生素处理，将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cm×0.5cm大小，吸取50μl浓度为100mg/ml的抗生素；待明胶充分吸收抗生素饱和后，夹含抗生素的明胶海绵，塞至阴道塞及宫腔内；抗生素处理6次，连续处理三天恢复一次；

(3)抗生素处理后将乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌按1：1：2比例，配制成浓度为30亿个/ml的混合细菌溶液；将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cm×0.5cm大小，吸取50μl使明胶海绵充分吸收；待明胶充分吸收抗生素饱和后，夹含抗生素的明胶海绵，塞至阴道及宫腔内并保持鼠倒立1-2min；空白组为pbs处理；造模处理7次，造模期间停药一天，造模后停药一天。

二、大鼠细菌性阴道炎模型的治疗

(1)造模成功后进行7次给药治疗。甲硝唑治疗组给药剂量，根据所购买甲硝唑药品说明以及经过等效剂量换算后得出，大鼠给药剂量16.2mg/200g。将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cm×0.5cm大小，吸取50μl药物使明胶海绵充分吸收药物后放入大鼠阴道内；本发明所述新型mg1363-pmg36e-cxcl12工程菌株配制1×10⁹cfu/ml的混合菌液；将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cm×0.5cm大小，吸取50μl菌液，使明胶海绵充分吸收药物后，放入大鼠阴道内，每只实验大鼠5×10⁷cfu；

(2)治疗恢复7天后，连续三天取各组大鼠阴道分泌物，提取阴道菌群，利用高通量测序技术分析工程菌株治疗后大鼠阴道微生物的种类和数量变化；

(3)摘除眼球取血后颈椎脱臼处死实验大鼠。解剖取大鼠阴道组织，部分置于4％多聚甲醛溶液保存，以进行he染色及免疫组化检测，部分置于液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存，以进行western-blot、elisa、q-pcr等检测。

三、动物实验阴道炎模型治疗后各项指标检测

1、大鼠子宫组织he染色

(1)脱水。将已经固定好的子宫取出，用pbs充分冲洗，然后乙醇脱水，分别用70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，95％乙醇脱水150min；然后用无水乙醇脱水两次，分别为60min；

(2)包埋。二甲苯处理脱水后的组织30min，石蜡进行包埋；

(3)切片和封片。轮转机切出平整平面，设置切面厚度为55μm，小心挑起切好的拉片，放置于水温为45℃的展片机水槽中，将有褶皱的蜡片展评；将蜡片置于载玻片上，放置在60℃烤片机上，烘烤4h；

(4)脱蜡。分别用二甲苯(i)、(ii)脱蜡15min，然后用二甲苯：无水乙醇1:1溶液处理5min，分别用浓度递减的乙醇溶液，100％乙醇，95％乙醇，80％乙醇，70％乙醇处理5min。

(5)染色。harris苏木素染色5min，分别用浓度递减的乙醇溶液，70％乙醇5，80％乙醇，95％乙醇，100％乙醇处理5min；0.5％伊红染色1min；依次用100％乙醇(i)、100％乙醇(ii)处理5min；分别加入二甲苯(i)、二甲苯(ii)中透明10min；中性树胶封片；

(6)观察。将封片置于光学显微镜下，分别在200倍与400倍镜下分别拍照观察，并作病理生理学分析。

2、大鼠子宫组织免疫组化

(1)同he染色常规脱蜡，脱水处理；

(2)为灭活内源性酶用3％新鲜配置的过氧化氢水溶液室温处理5-10min，用去离子水洗3次；

(3)将切片浸入浓度为0.01mol/lph＝6.0枸橼酸盐缓冲液中，加热至沸腾后停止加热，自然冷却5-l0min后，在重复此操作1-2次，冷却后用ph＝7.2-7.6的pbs，洗涤1-2次；

(4)用抗原修复液1室温条件下孵育切片10min，抗原修复液1滴加在切片上并用ph＝7.2-7.6的pbs，洗涤1-2次；

(5)室温条件下用5％小牛血清封闭切片20min，除尽多余的水分；

(6)分别滴加1:400兔抗caspase-3、caspase-8、fasl一抗，37℃孵育30min，4℃过夜，ph＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，洗涤2min，洗3次；

(7)滴加1:150生物素二抗(山羊抗兔caspase-3、caspase-8、fasl)，37℃温育30min，ph＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液洗3次；

(8)滴加1:150sp复合物，37℃孵育30min，ph＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，洗涤5min，洗3次；

(9)微量移液枪吸取1ml去离子水，加dab显色剂a，b，c各1滴，混匀；

(10)室温条件下吸取50μl显色剂，镜下控制反应时间为5-30min，显色完毕后用去离子水充分洗涤以终止反应；

(11)苏木素复染1min、按照he染色常规步骤脱水、脱错、透明、封片，镜下观察，分别在200倍与400倍镜下分别拍照观察，并作病理生理学分析。

3、工程菌株调控炎症信号通路相关蛋白的表达

检测细菌性阴道炎大鼠模型经工程菌株治疗后阴道组织中炎症相关信号通路tlr4-nf-κb、mapk、pi3k/akt的蛋白表达情况，以分析阴道局部免疫状况和临床治疗效。此项评价通过western-blot显示。

大鼠处死后，提取阴道组织蛋白，进行western-blot。

(1)大鼠阴道组织蛋白提取

①组织用含pmsf(1mm)的无菌冰去离子水冲洗数次；

②将组织放置匀浆器中，加入适量裂解液缓冲液ripa及蛋白酶抑制剂，冰水混合浴中匀浆；

③裂解产生的蛋白溶液全部转移至1.5mlep管中；

④1.5ml管置于冰上，漩涡震荡10s，放置5min，重复3-4次；

⑤4℃，13000rpm离心10min；

⑥吸取上清至全新1.5mlep管中，-80℃冰箱保存，上清即为全蛋白。

(2)western-blot

①在收集的蛋白样品中加入适量的4x蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热10min，以充分变性蛋白；

②配制5％的浓缩胶，10％或12％分离胶，待胶凝固后，将胶浸入1x电泳缓冲液中，上样电泳；

③电泳完成后，将胶剥离玻璃板，转膜待用。将pvdf膜用1x转膜缓冲液完全浸润后，胶和膜用夹板夹好，进行转膜；

④转膜完成后，取出pvdf膜，用5％脱脂乳或5％bsa封闭后，添加目标蛋白的一抗后4℃孵育过夜，再添加hrp标记的二抗孵育2h，进行显色曝光；

⑤对显色内容进行拍照，使用软件分析灰度，作图分析。

4、工程菌株调控炎症因子的表达

检测细菌性阴道炎大鼠模型经工程菌株治疗后阴道组织中tnf-α、il-1β、il-6、il-17、il-4、il-22、tgf-β及血清中tnf-α、il-1β、il-6和il-4的表达量，以分析阴道局部免疫状况和临床治疗效。所述新型mg1363-pmg36e-cxcl12工程菌株在阴道内，抑制部分致炎因子的释放，进一步地，所述致炎因子为tnf-α、il-1β、il-6、il-17；促进抑炎因子il-4、il-22、tgf-β的表达。这种抑制和促进体现在mrna水平，影响促炎及抑炎性因子的转录，下调、上调炎症介质mrna的表达量，此项评价通过q-pcr显示。也体现在蛋白水平，影响促炎性及抑炎因子的翻译，下调、上调炎症介质蛋白的表达量，此项评价通过elisa显示。

大鼠处死后，提取阴道组织rna，反转录成cdna后进行q-pcr，检测阴道组织中炎症因子tnf-α、il-1β、il-6、il-17和il-4、il-22、tgf-β转录水平的表达情况。

(1)大鼠阴道组织rna的提取

①取相同质量的大鼠子宫内膜组织，加入1mltrizol，用剪刀剪碎，并用组织匀浆机匀浆，5000rpm10min，转移上清至新的ep管中；

②加入氯仿160μl，充分振荡混匀，4℃13000rpm15min，离心完毕，吸取上清，注意不要吸到蛋白层；

③加入等体积异丙醇，充分混匀，4℃13000rpm10min，倒去上清；

④加入1ml75％乙醇洗涤，振荡，充分溶解后，4℃13000rpm10min，弃上清；

⑤加入1ml无水乙醇洗涤，振荡，充分溶解后，4℃13000rpm10min，弃上清；

⑥常温晾干30min；

⑦加160μlrnasefreewater，55℃促溶；

⑧测定rna浓度。

(2)rt-pcr

参照takara试剂盒说明书进行操作。

大鼠处死前进行摘除眼球取血，离心分离血清，elisa检测血清中炎症因子tnf-α、il-1β、il-6和il-4蛋白水平的表达情况。

(1)elisa实验步骤

①使用前讲试剂盒在室温下平衡半小时；

②空白孔不加样，只加a，b和终止液用于调零；

③标准品孔：每孔加好稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl；

④样品孔：加入稀释好3倍的样品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl；

⑤轻轻摇晃，盖上封膜板，37℃培养60min；

⑥将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用；

⑦第一次洗涤：小心揭开封膜板，弃去液体，甩干，每孔加入200μl，静置30s后弃去，拍干，如此重复3次；

⑧加入50μl亲和素-hrp到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封膜板，37℃培养60min；

⑨第二次洗涤：小心揭开封膜板，弃去液体，甩干，每孔加入200μl，静置30s后弃去，拍干，如此重复3次；

⑩显色：每孔加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min；

终止：每孔加入终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转为黄色)。

测定：酶标仪，450nm波长，测od值。

5、大鼠阴道菌群高通量测序分析

检测细菌性阴道炎大鼠模型经工程菌株治疗后阴道分泌物中菌群种类及数量变化，以分析阴道局部免疫状况和临床治疗效。提取的阴道微生物基因组dna，送北京诺禾致源公司进行16srrna测序。以提取的基因组dna为模板，使用具有编码基因的引物对338f/806r扩增16srrna基因的v3-v4区。构建文库并上机测序，从而得到每个样品的otus。根据得到的otus数目可以进行进行丰度、多样性指数等数据的分析，同时在各个分类水平上对物种注释进行群落结构的统计分析。在此基础上，可以进行基于otus、物种组成的一系列聚类分析，进一步挖掘出样品组间与组内物种的差异。

利用本发明提供的益生菌与小分子多肽结合使用的新方法，形成的新型mg1363-pmg36e-cxcl12工程菌株，治疗细菌性阴道炎大鼠模型，以期通过恢复阴道菌群平衡、参与局部炎症反应和组织修复来提高bv治疗功效。