控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用的制作方法
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qslwa9的克隆与育种应用。本发明具体涉及控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qslwa9的分离克隆、功能验证及应用。
背景技术：
甘蓝型油菜(brassicanapusl.)是一种被广泛种植的油料作物，其产量的提高是油菜育种中的重要目标。油菜的籽粒产量主要由单位面积有效角果数、每角果粒数和粒重三大因子构成，每个构成因子都在产量的提高中都发挥着重要作用(chenetal.,2007)。这些产量相关性状都是典型的数量性状，由数量性状基因位点(qtl)控制。甘蓝型油菜是由二倍体的祖先种白菜(b.rapa)和甘蓝(b.oleracea)通过自然杂交并经历全基因组加倍而形成的异源四倍体物种(chalhoubetal.,2014)，基因组的复杂性增加了对产量相关性状qtl基因克隆的难度。目前，甘蓝型油菜产量相关性状的研究仍集中在qtl的定位工作上，成功通过图位克隆技术克隆到基因的报道还很少。因此，克隆产量相关性状的qtl基因，揭示其分子机理，对提高油菜产量具有重要意义。
角果作为包含种子的重要器官，不仅保护种子免受外界病虫等的危害，同时也为种子提供其发育所需的光合产物和营养物质(bennettetal.,2011)。此外，研究表明，角果皮的光合作用也与籽粒的油份含量密切相关(huaetal.,2012)。
角果的长度与每角果籽粒数和粒重呈正相关。长角果能够提供更大的光合面积和营养物质存储空间，为种子合成更多的油份和蛋白质等物质提供基础，增加了籽粒大小和重量。前人研究表明，在一定范围内，角果长度的增加可以提高每角果粒数和粒重(chayandthurling1989；刘定富等，1994；冷锁虎等，2005)。“川农长角”是四川省农业科学院在上世纪六十年代选育的高产油菜品种(覃民权等，1962)，中双11号(zs11)是中国农业科学院油料作物研究所选育的一个高产品种(余波，2008)。这两个品种的共同特点是角果长，千粒重高(lietal.,2014)。育种实践表明，适当增加甘蓝型油菜的角果的长度，增加千粒重是提高产量的有效途径。因此，定位并克隆控制角果长和粒重的主效qtl基因，可以为油菜高产育种提供分子标记和目标基因，有针对性地开展分子标记辅助高产育种。
技术实现要素：
本发明的目的通过图位克隆提供一种控制甘蓝型油菜角果长和粒重的qtl基因qslwa9，利用该基因进行甘蓝型油菜的高产育种的改良。
申请人将本发明克隆的调控甘蓝型油菜角果长和粒重的qtl主效基因命名为siliquelengthandseedweighta9基因(简称qslwa9基因)，该基因的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示，序列全长为1756bp，其编码区即cds序列如seqidno：2所示，该基因(即seqidno:2)编码的蛋白质序列如seqidno:3所示。该基因编码一个细胞色素单加氧酶家族成员cyp78a9。通过遗传互补实验、表达实验等证实了qslwa9基因表达量的升高可使角果长度和粒重增加。
本发明的技术方案如下：
利用一个由甘蓝型油菜自交系s1(一个公知公用的甘蓝型油菜材料)和s2(一个公知公用的甘蓝型油菜材料)衍生出的共189个重组自交系(命名为l001，l002，……，l186)(yangetal.,2012)进行qtl定位时，在a9染色体上鉴定出一个同时控制角果长和千粒重的主效qtl，来自亲本s1的等位基因型能够同时增加角果长和千粒重(yangetal.,2012)。l133是该qtl为杂合基因型的残余杂合系，其自交的后代单株中，l133-2(nil(s1))株表现是长角果、大粒，qtl位点为s1纯合基因型，l133-3(nil(s1))株表现是短角果、小粒，qtl位点为s2纯合基因型，将两个单株杂交的f1代单株套袋自交，产生的f2分离群体用于精细定位。
通过一个包含9737株大的分离群体的基因型和表型的鉴定，最终将qtl区间定位在标记sl5和sl15之间。
通过对该区段内基因表达水平，确定了两个候选基因。
通过对候选基因在亲本中(s1与s2)的比较测序，发现这两个候选基因中的一个基因的氨基酸序列在亲本间无差异，s1与s2相比较，s1该基因的起始密码子(atg)上游3.9-kb区段内存在一个核苷酸的改变和2个氨基酸的插入，在3.9-kb处插入了一段3.7-kb的dna片段；另一个候选基因在s1基因组中缺失。
遗传转化实验表明，在s1基因组中缺失的基因不是目的基因，而另一个候选基因(qslwa9)的起始密码子上游3.9-kb处插入的3.7-kb而不是3.9-kb序列上核苷酸的变化能互补短角果受体的表型，使得角果长和千粒重增加。
利用qrt-pcr和gus组织化学染色实验分析了qslwa9基因在甘蓝型油菜中的各组织表达情况。
本发明获得一种控制甘蓝型油菜角果长、粒重性状的基因qslwa9，其核苷酸序列如序列表seqidno:1所示。该基因编码的蛋白质序列如seqidno:3所示。
本发明克隆的基因qslwa9可在甘蓝型油菜改良和高产育种中的应用。
申请人优选了一种适用于油菜改良的分子标记，该分子标记的序列如下所示(即序列表seqidno:4,seqidno:5所对应的序列)：
正向引物：cacacactctctccctctcctt，
反向引物：atgaacacaacacaccggataa。
本发明的分子标记可在甘蓝型油菜辅助选择中的应用。
本发明的优点在于：在甘蓝型油菜中克隆了一个对角果长、粒重产量相关性状具有较大正调控效应的主效qtl基因qslwa9，为甘蓝型油菜的高产育种提供了新的基因资源。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表seqidno:1是本发明克隆的主效基因qslwa9的核苷酸序列。序列长度为1756bp。
序列表seqidno:2是本发明克隆的主效基因qslwa9的cds序列。序列长度为1599bp。
序列表seqidno:3是本发明克隆的主效基因qslwa9编码的蛋白质序列。编码532个蛋白质。
序列表seqidno:4是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4935)的序列。
序列表seqidno:5是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4935)的序列。
序列表seqidno:6是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4931)的序列。
序列表seqidno:7是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4931)的序列。
序列表seqidno:8是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4937)的序列。
序列表seqidno:9是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4937)的序列。
序列表seqidno:10是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4940)的序列。
序列表seqidno：11是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4940)的序列。
序列表seqidno:12是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4942)的序列。
序列表seqidno：13是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4942)的序列。
序列表seqidno:14是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4944)的序列。
序列表seqidno：15是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4944)的序列。
序列表seqidno:16是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4946)的序列。
序列表seqidno：17是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4946)的序列。
序列表seqidno:18是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称bnems799a)的序列。
序列表seqidno：19是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称bnems799a)的序列。
序列表seqidno:20是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4950)的序列。
序列表seqidno：21是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4950)的序列。
序列表seqidno:22是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4952)的序列。
序列表seqidno：23是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4952)的序列。
序列表seqidno:24是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4956)的序列。
序列表seqidno：25是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4956)的序列。
序列表seqidno:26是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称brgms4958)的序列。
序列表seqidno：27是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称brgms4958)的序列。
序列表seqidno:28是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl16)的序列。
序列表seqidno:29是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl16)的序列。
序列表seqidno:30是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl17)的序列。
序列表seqidno:31是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl17)的序列。
序列表seqidno:32是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl5)的序列。
序列表seqidno:33是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl5)的序列。
序列表seqidno:34是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl14)的序列。
序列表seqidno:35是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl14)的序列。
序列表seqidno:36是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl15)的序列。
序列表seqidno:37是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl15)的序列。
序列表seqidno:38是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl24)的序列。
序列表seqidno:39是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl24)的序列。
序列表seqidno:40是本发明优选的分子标记(正向引物，即标记名称sl7)的序列。
序列表seqidno:41是本发明优选的分子标记(反向引物，即标记名称sl7)的序列。
图1、本发明的技术路线图。
图2、本发明所用亲本s1、s2及近等基因系亲本nil(s1)、nil(s2)的角果长度、籽粒大小的表型。附图标记说明：图2中的a图,图2中的e图：亲本及近等基因系角果长直观图，bar＝1cm；图2中的b图,图2中的f图：亲本及近等基因系角果长统计图；图2中的c图,图2中的g图：亲本及近等基因系籽粒大小直观图，bar＝0.5cm；d,h：亲本及近等基因系千粒重统计图；图2中的b图,d图,f图和h图中的p值是进行双尾的t检验获得的。
图3、qslwa9精细定位图。附图中标记说明：图3中的a图、b图、c图中黑线上的竖短线上面的表示是分子标记名称，下面对应的数字表示在相应标记处为交换单株数目，图3中的b图中的n表示f2分离群体的单株数目；图3中的c图表示有代表的4个f2交换单株(编号是rl10632,rl7977,rl540,rl10080)自交后代中纯合重组单株的基因型和表型，显著性差异p-value是和nil(s2)进行双尾的t检验获得，黑色填充的框代表s1纯合基因型，无填充的白色框代表s2纯合基因型；图3中的d图表示精细定位区段内的基因情况，带箭头的灰色框代表基因，框下方是基因编号。
图4、rt-pcr分析候选区段内基因的表达情况。
图5、候选基因及其启动子的序列比较示意图。附图中标记说明：图5中的a图表示bnaa09g55530d基因起始密码子(atg)上游3.9-kb序列在亲本及油菜参考基因组darmor_bzh和中双11(zs11)之间核苷酸的差异；图5中的b图表示zs11与白菜chiifu-401-42和darmor_bzh比在atg上游插入了一段3.7-kb核苷酸序列。
图6、候选基因遗传转化的植株角果长表型数据统计图。附图中标记说明：图6中的a图表示35s启动子超表达候选基因bnaa09g55530d转化s1受体的t0代角果长表型统计图。图6中的b图表示来源于双亲等位的bnaa09g55530d基因起始密码子上游3.9-kb序列及基因遗传转化油菜受体westar的t1代角果长表型数据统计图。
图7、来自s1亲本bnaa09g55530d基因的启动子(含插入的的3.7-kb及atg上游的3.9-kb序列)及基因的表达载体转遗传转化油菜受体westar的表型和和数据统计图及表达分析。附图标记说明：图7中的a图：t0代角果长统计图；图7中的b图：阳性转化株系角果皮中基因的表达水平；图7中的c图：t1代角果长直观图，bar＝1cm；图7中的d图：t1代千粒重直观图,bar＝0.5cm；e：t1代角果长阳性株、阴性株、受体比较柱形图；图7中的f图：t1代千粒重阳性株、阴性株、受体比较柱形图。图7中的e图和图7中的f图中的***表示p<0.001。
图8、qrt-pcr分析qslwa9基因的表达情况。附图标记说明：图8中的a图：亲本各组织qslwa9基因的表达情况。图8中的b图：基因在双亲角果不同发育阶段的表达水平。图8中的b图显示：qslwa9基因融合atg上游3.9-kb序列驱动gus的转基因拟南芥组织化学染色，从左到右依次是幼苗、花蕾、叶片、茎、角果及角果特写，除最后一张图的bar＝200um外，其余组织照片bar＝1mm。
图9、本发明所用的载体图。附图标记说明：从上到下依次为，图9中的a图是
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步解释本发明，并描述了本发明的前期工作基础(技术路线图1所示)。实施例不对本发明做任何形式的限定，本发明的保护范围以权利要求书为准。下述实施例中的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域的常规方法和技术，所使用的实验材料、试剂配方，如无特殊说明，均可通过商业途径购得。
实施例1：qslwa9的精细定位
首先，将初定位qtl区间两端的标记na10-b07和bogms116(见图3中的a图)比对到已测序的白菜品种chiifu-40-42(wangetal.,2011)基因组a9染色体上，利用这两标记间的物理序列和在线软件msatfinderon-linev2.0(http://www,genomics.ceh.ac.uk/cgi-bin/msatfinder/msatfinder_v_1_0.cgi/)来设计ssr引物，通过亲本混合的dnabulk池的筛选，确定了11个有多态性且条带清晰的ssr标记(见图3中的b图)。用标记na10-b07和bogms116筛选一个含9737株单株的大的分离群体，鉴定出492株交换单株，由于种植方式、养分、病虫害等因素可能会使得长角果基因型的单株受影响而表现为短角果，所以，本实施例从492株单株中选取了角果长度大于9.5cm且na10-b07或bogms116基因型为s2纯合的72株交换单株用于近一步缩小区间。用新开发的11个ssr标记分析这72株单株的基因型，角果成熟时测量植株主花序中部5-10个角果的角果长度，qslwa9被缩小至标记brgms4931和brgms4937间，两标记间有6个交换单株(见图3中的b图)，共分离的分子标记brgms4935可应用于甘蓝型油菜的辅助选择中。随后，依据s1、s2重测序的序列及公开的甘蓝型油菜测序品种darmor-bzh的基因组序列(chalhoubetal.,2014)，在brgms4931和brgms4940间新开发了5个insertions/deletions(indels)标记，分析这6个交换单株的f3家系中纯合重组单株的基因型和表型分析，将qslwa9基因定位在了标记sl5和sl15之间(见图3中的c图)。
本发明设计的分子标记信息见表1。从甘蓝型油菜幼叶中提取基因组dna(按常规方法，即采用2％ctab小量法)。标记的pcr反应体系采用10ul体系：50ng基因组dna，1×pcrbuffer(含2mmmgcl2)缓冲液，0.2mmdntp，0.2um引物，0.25utaqdna聚合酶。pcr反应程序：94℃3min变性；94℃30s，56℃30s,72℃45s，32个循环；72℃5min延伸。反应完成后加入上样缓冲液loading，在6％的聚丙烯酰胺变性胶上电泳，之后按照银染标准程序处理并记录条带基因型。
表1qslwa9基因精细定位中新开发的标记
实施例2：qslwa9候选基因的确定
依据甘蓝型油菜公布的基因组注释(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)，标记sl5和sl15之间共有13个预测的基因(如bnaa09g55520d，bnaa09g55530d，bnaa09g55540d，bnaa09g55550d，bnaa09g55560d，bnaa09g39461d，bnaa09g39470d，bnaa09g39480d，bnaa09g39490d，bnaa09g39500d，bnaa09g39510d，bnaa09g39520d，bnaa09g39530d)。采用常规的trizol提取方法提取双亲即s1、s2花后25天角果皮的rna，使用含dnasei的试剂盒(reveraidfirststrandcdnasynthesiskit，来自thermoscientific公司,usa)合成cdna。设计这13个基因的特异引物，以bnenth作为内参引物(yangetal.,2014)，用半定量rt-pcr(reverse-transcriptpcr)方法分析了这些基因在双亲中的表达情况。发现除基因bnaa09g55530d表达差异显著，基因bnaa09g55520d只在s2中表达s1不表达外，其他基因在角果皮中表达差异不明显或不表达(见图4),因此将基因bnaa09g55530d和bnaa09g55520d作为qslwa9的候选基因。本发明候选区段内基因的rt-pcr的引物序列如表2所述。
表2候选区段内基因rt-pcr所用引物
实施例3：候选基因的比较测序
将候选基因所在的基因组区段在已公开的中双11号(zs11)(一个在中国广泛种植的长角果商业化品种)(lietal.,2014)(sunetal.,2017)、darmor-bzh(一个拥有普通长度角果的法国油菜品种)及白菜chiifu-401-42基因组中进行比较分析，基因bnaa09g55530d的编码区没有差异，在zs11基因组中基因bnaa09g55530d起始密码子上游3.9-kb处插入一段3.7-kb序列，而基因bnaa09g55520d在zs11基因组中缺失(见图5中的b图)，进一步的测序结果表明，基因bnaa09g55520d在长果亲本s1基因组中缺失，而在s2基因组中存在，s1和s2基因组中的bnaa09g55530d编码区的核苷酸序列没有差异(见序列表seqidno:1)，其编码的氨基酸序列见序列表seqidno:2。该基因翻译起始密码子atg上游约3.9-kb的区段内有4个碱基的差异(见图5中的a图)，且s1基因组基因bnaa09g55530d起始密码子上游3.9-kb处也插入一段3.7-kb序列。
实施例4：候选基因的油菜遗传转化确定目的基因
为了确定qslwa9的目的基因，对候选基因进行了油菜的遗传转化验证实验。
根据甘蓝型油菜的参考基因组序列，设计基因bnaa09g55520d引物(正向引物：atggaagaaggagacgttttc；反向引物：tcatgaccaaaagtcccac)并从s2基因组中扩增出序列，扩增出的片段用pcr产物纯化试剂盒(购自上海生工生物工程服务有限公司)纯化，利用t4连接酶(购自newenglandbiolabs公司)将片段连接进
利用农杆菌介导的甘蓝型油菜转化体系将载体转化油菜亲本s1，获得17株t0(转化当代)阳性株，t0代的角果长在受体、转基因阳性株、阴性株之间没有显著差异(见图6中的a图)，且经过了后代验证。因此，bnaa09g55520d不是qslwa9的目的基因。
为了确保在异源四倍体的甘蓝型油菜中扩增bnaa09g55530d基因及其启动子的特异序列，采用二次pcr的策略。根据darmor-bzh参考基因组序列，从s2基因组中设计能扩出含该基因及其启动子特异序列的大片段引物s2-7.8，
其中：
正向引物序列为：tcctctagagtcgacctgcaatctaatcaagaagacaactatagccttcac，
反向引物序列：ggggaaattcgagctggtcaccgagaaggggaaaattagctagtaatcttttgaa；
利用高保真pcr聚合酶kod-plus-neo(购自toyobo公司)扩增获得7.8kb片段，将扩增的产物稀释10倍后作为二次pcr的模板，同理，根据甘蓝型油菜中双11号(zs11，来自中国农业科学院油料作物研究所)的参考基因组序列，设计能从s1基因组中扩增出约10.4kb片段的引物s1-10.4，其中：
正向引物序列：gaaagatacaagtggctatatggtcatgattg，
反向引物序列：gagaaggggaaaattagctagtaatcttttgaa；
产物稀释后作为二次pcr的模板。
进一步设计出能扩增出s1和s2的基因及atg上游3.9-kb的等位基因序列的引物p5.5，加上psti和bsteii酶切位点后的左、右引物的序列是：
左引物：agaactgcagataatataaaagactatataaacggacagatg，
右引物：gctgggtcacctctttttccttcaacgtataattgcatta；
利用高保真pcr聚合酶kod-plus(购自toyobo公司)第二次扩增获得约5.5-kb片段，通过片段回收、酶切、连接、转化、测序等步骤，最终构建出以pcambia2301(见图9中的c图)为骨架的表达载体s1-p3.9-qslwa9-p2301及s2-p3.9-qslwa9-p2301，并电击入农杆菌gv3101中，验证并保存菌株，等待转化一个表现普通角果长(约5-6cm)和千粒重的甘蓝型油菜品种westar(一个公知公用的品种)。
利用s1-p3.9-qslwa9-p2301及s2-p3.9-qslwa9-p2301转基因油菜分别获得转基因当代t0代阳性株32株和35株，考察角果长的长度，未超过7.5cm。各选取11株t0代的单株自交，在t1代角果成熟时考察角果长表型，westar受体、转基因阳性株、转基因阴性株间的表型并无显著差距(见图6中的b图)。另外，bnaa09g55530d基因atg上游3.9-kb的序列差异在长角果的s1、zs11中和短角果的s2、darmor_bzh中并没有规律。因此，bnaa09g55530d基因atg上游3.9-kb的序列并不是引起bnaa09g55530d基因在s1中表达量高于s2的原因。
进一步地，为了扩增插入s1基因组的3.7-kb片段，首先，设计含此序列的特异引物s1-6s(正向引物序列：caattaagcacttacaaatgttccctatccata；反向引物序列：agcagtaaaattatccttaccgactga)，以s1基因组为模板扩增出6kb的片段，将此pcr产物稀释50倍作为第二次pcr的模板，再设计扩增3.7kb序列的引物s1-te(正向引物序列为：gtatcccccgggttatcttggctctctcaatggtgccaaat；反向引物序列agtcttttatattatctgcagtactatatacactacaagaaaacatattttttacgagg)，引入酶切位点smai和psti，kod-plus扩增后，通过纯化、酶切，连接进经smai和psti双酶切的s1-p3.9-qslwa9-p2301的融合载体中得到载体s1-10，经测序验证后转入gv3101中，最后转化甘蓝型油菜品种westar。
观察转基因t0代角果长的表型，发现有7个单株的角果有不同程度的增长(见图7中的a图)，选取3个株系(编号sz-15、sz-3、sz-23)继续观察t1代表型，t1代中，转基因阳性株的角果长与阴性株和受体westar的差异达到极其显著水平(***p-value<0.001，t-test检测)(见图7中的c图、图7中的e图)。另外，千粒重的差异也达到极其显著水平(***p-value<0.001，t-test检测)(图7中的d图、图7中的f图)。提取sz-15、sz-3、sz-23这3个株系t1代阳性单株、阴性株及受体westar角果皮的rna并进行荧光定量pcr(qrt-pcr)。表达分析表明，阳性转基因植株角果皮的表达量要明显高于转基因阴性株和westar0的，qslwa9的表达量在sz-3株系的阳性株的角果皮中甚至是阴性株的67倍(见图7中的b图)。确定bnaa09g55530d即是qslwa9的目标基因，且插入的3.7-kb片段使得基因bnaa09g55530d的表达量升高，进行导致了角果的伸长和千粒重的增加。
实施例5：qslwa9基因的表达分析
用荧光定量pcr(qrt-pcr)的方法分析该基因的表达模式。设计qrt-pcr引物qa9，引物序列为：正向引物qa9f：aactcgtgactcgcctagc，反向引物qa9r：atcctagcaagaacccac，油菜基因bnenth作为内参。提取亲本s1、s2的子叶、根、茎、叶、花蕾、角果皮、种子各组织的rna并反转为cdna(操作方法同实施例2)，将各组织的cdna浓度统一调整为50ng/ul作为qrt-pcr分析模板。参照chamqtmsybrcolorqrcrmix(购自vazyme公司)的说明来配置qpcr的反应体系及扩增程序，使用的仪器是cfx96tmreal-timesystem(bio-rad)，每个样品设置3次生物学重复和3次技术重复。最后，根据2-△△ct的方法分析结果。如图8中的a图所示，bnaa09g55530d基因在子叶、根、茎、叶、花蕾、角果皮、种子各组织中都表达，且表达量最高的是在角果皮中，其次是种子；比较s1和s2各组织该基因的表达水平，s1在子叶、茎、叶、花蕾、角果皮、种子组织中表达量均高于s2的，只有根中基因的表达量是s2高于s1的。
为了进一步的考察qslwa9基因的表达模式，我们以pcambia3301(见图9中的d图)为骨架，首先通过在酶切位点hindiii和pmli处插入β-glucuronidase(gus)报告基因(见图9中的e图)，利用引物pbnaa09g55530dgus-f(tcctctagagtcgacctgcagataatataaaagactatataaacggacagatg)和pbnaa09g55530dgus-r(acgacggccagtgccaagcttggaagcagagaaagagataaaaaaaggt)从s2基因组中扩出bnaa09g55530d起始密码子atg上游3.9-kb的启动子序列通过酶切位点psti和hindiii连接进入该载体中，将检测成功的融合载体转化农杆菌gv3101，再通过蘸花法转化野生型拟南芥col-0。取t3代植株的幼苗、茎、花蕾、角果等组织，用gus染液进行组织化学染色。
本实施所用的gus染液包括0.5mm的铁氰化钾、0.5mm的亚铁氰化钾、0.1m的磷酸缓冲液(ph＝7.2)、0.1％tritonx-100及显色底物2mmx-gluc(新鲜配制)。染色步骤为：将组织放入含90％丙酮离心管中冰上固定20min；之后用灭菌的ddh20清洗3遍；加入适量的gus染液37℃过夜培养；70％酒精脱色3次，每30min一次。
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