OsLUT2基因在水稻光保护中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及oslut2基因在调控水稻光保护中的应用。所述的oslut2基因是一种水稻番茄红素ε环化酶(lycopeneepsiloncyclase)基因(登陆号为os01g0581300)，本发明验证该基因的功能及其在水稻光保护中的应用，为水稻的遗传改良提供了新的遗传资源的应用途径。
背景技术：
：光是植物光合作用所必需的，植物光合机构中叶绿体色素吸收的光能通过光化学过程转化为稳定的化学能。然而，大多数情况下植物接受的能量要超过其所能转化的能量，如果过量的光能不及时耗散掉，光合功能会降低，导致光合作用的光抑制，甚至出现光氧化、光破坏。当高温、低温、水分亏缺、营养不足等环境胁迫因素同时存在时，植物对光抑制条件的敏感性增加，在中、低光强下便会发生光抑制。植物在进化过程中形成多种保护机制，其中依赖于叶黄素循环(xanthophyllcycle)的热耗散作用在近年来受到普遍关注。它在耗散激发能中起着重要的作用，被认为是光保护的主要途径。然而，除了叶黄素循环色素外，α-胡萝卜素衍生的黄体素，作为捕光复合体亚基的结构组分，通过促进植物吸收的过剩光能的耗散保护植物避免光氧化损伤。此外，许多体外研究证明，黄体素的抗氧化功能主要是通过淬灭单线态氧和清除氧自由基来保护光合机构避免光氧化损伤。水稻中番茄红素ε环化酶(lycopeneepsiloncyclase)由oslut2所编码，是黄体素合成途径的重要酶之一。因此，研究oslut2基因与植物光保护之间的关系具有重要意义。当植物吸收的光能超过其所需时，过剩的光能会导致光抑制现象，从而明显降低光合效率。研究表明，当照射在叶片的光量子流量密度达到最大阳光辐射强度的1/4时，叶片光合速率a即已趋于饱和。不能用于光化学反应，也不能以荧光及热的形式耗散的激发能将转移到氧分子，产生对光合机构具高度破坏性的活性氧自由基。热耗散是以反馈去激发机制介导进行的，可以通过测量叶绿素荧光非光化淬灭(non-photochemicalquenching,npq)参数来衡量。非光化淬灭调节着光系统ii的能量转换，保护植物免受或减轻光抑制。非光化淬灭由高光强诱导产生，随着关闭高光强而弛豫。根据其弛豫动力学(relaxationkinetics)特性，非光化淬灭可以分为至少3个组分：依赖能量的淬灭qe、状态转换淬灭qt及光抑制淬灭qi，其中qe是高等植物中的最主要组分。对模式植物拟南芥的研究表明，类囊体跨膜ph梯度、叶黄素循环中合成积累的玉米黄素、光系统ⅱpsbs蛋白及其表达量是控制非光化淬灭产生以及决定qe及整个npq容量大小的重要因子。现阶段认为qe的作用模式如下：当光合作用中光反应产生的化学能超过了同化反应如co2固定的能力时，叶绿体类囊体腔内酸性逐渐增强。ph值不断下降激活了紫黄素脱环氧酶(violaxanthinde-epoxidase)，在强光下该酶促进紫黄素转变为玉米黄素。玉米黄素具双重功能，它一方面参与了非光化淬灭的形成，另外还具有直接的抗氧化剂功能。叶绿体类囊体腔ph值下降还促进了光系统ⅱpsbs蛋白的质子化，接着导致与叶绿素及类胡萝卜素结合的捕光蛋白复合体构象的改变。过剩激发能的耗散是通过类胡萝卜素自由基阳离子电荷传递机制以及叶绿素与类胡萝卜素之间的能量传递进行的。黄体素(c40h56o2)是一种双羟基的叶黄素，与玉米黄质互为同分异构体。在高等植物中主要的类胡萝卜素是黄体素、胡萝卜素、紫黄质、花药黄质、玉米黄质、新黄质等，其中以黄体素的含量为最多。不少研究证明黄体素与玉米黄质一样可直接或间接的介导非光化学猝灭的快速诱导，耗散吸收到的过剩光能，从而防止叶绿体受到光氧化损伤。目前对黄体素直接或间接介导npq诱导的机制，有两种不同的观点。一种认为黄体素间接诱导npq的依据是：缺乏黄体素后突变体的psii天线也相应地变小，失去黄体素的天线会改变捕光色素复合体的结构，并诱导构象的变化，从而减少了光能猝灭速率，所以黄体素或许不会直接存在于能量猝灭机制中。而另一种认为黄体素直接诱导npq机制的观点为是：黄体素的激发能态与叶绿素的激发态二者的光谱之间有重叠，黄体素的光物理能力及其位点是猝灭单线态叶绿素chl所必须的，所以认为黄体素作为一种能量的猝灭剂直接介导了npq的诱导高等植物的抗氧化防御系统由一些酶类和非酶类抗氧化剂所组成的复杂网络所构成。在一些体外模式的研究中，已经证明黄体素具有猝灭单线态氧o2和清除自由基的功能。水稻通常在高自然光强条件下生长，晴朗的中午光合光量子流量密度(ppfd)一般在2,000μmolm-2s-1以上，其光合作用在远低于最大光强时就已经饱和。qe在水稻大部分叶片中均会被强烈诱导，以安全耗散过剩激发能、避免或减轻光抑制，这对于水稻可持续健康生长非常重要。目前在水稻中仅克隆了控制qe值的基因ospsbs1，该基因表达量与植株npq值呈显著正相关。本发明利用crispr技术抑制了该基因的表达，从而来观察植物的表型，验证基因的功能。证明了在水稻中oslut2基因控制npq等表型，对水稻的强光保护发挥了重要作用。crispr技术原理：当细菌抵御噬菌体等外源dna入侵时，在前导区的调控下，crispr被转录为长的rna前体(prerisprrna，pre-crrna)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crrna，最终识别并结合到与其互补的外源dna序列上发挥剪切作用。crispr就是利用这一系统，人工引入一段和目标dna靶向的序列。这样在细胞内crrna、tracrrna和cas9组成复合体，识别并结合于crrna互补的序列，然后解开dna双链，形成r-loop，使crrna与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由cas9中的hnh活性位点剪切crrna的互补dna链，ruvc活性位点剪切非互补链，最终引入dna双链断裂(dsb)。使目标dna形成不同大小的缺失，导致目标基因无法以正常水平转录翻译。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从水稻中克隆得到一种oslut2基因，利用crispr技术构建成功转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化将所述的oslut2基因导入水稻宿主中，本发明同时通过在转基因试验中敲除该基因从而抑制了该基因的表达，进一步地研究了该基因在水稻植株内的功能表达，验证了该基因在水稻中的生理功能，证明该基因在植物强光保护中起到重要作用。本发明的技术方案如下所示申请人分离克隆了一种对水稻光保护具有作用的功能基因，该基因被命名为oslut2基因，它的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示，其在ncbi数据库中的登录号为xm_015766712，蛋白注释为chloroplasticlycopeneepsiloncyclase。在该基因所示的3745bp的序列的第388-407；1894-1913是该基因特异性靶标位，其中在该基因序列的1908—1911碱基位缺失了四个碱基：cttt。对该分离基因进行的生物学功能验证，表明oslut2基因在对水稻光保护中起到重要的作用，通过遗传转化试验进一步验证了oslut2基因的应用途径。由表2、表3和图3可以看出，转基因阳性植株的npq值明显低于转基因阴性植株。表明lut2基因利用crispr技术敲除后使植物的光保护能力有显著性下降，证明lut2基因对水稻的光保护过程起一定的调控作用。附图说明序列表seqidno:1是本发明克隆的与调控水稻光保护能力的基因oslut2的核苷酸序列(3745bp)。图1：是本发明的技术路线图。图2：t0转oslut2基因再生植株阳性检测胶图。图3：t0代转oslut2基因再生植株表型分布与显著性检验。图4：本发明涉及的crispr/grnavectors质粒构建路线和图谱。图5：本发明涉及的pylcrispr/cas9-mh(b)质粒构建路线和图谱。图6：本发明涉及的pylcrispr/cas9-mh–lut2质粒构建路线和图谱。附图标记说明：t1为第一个靶点agtccatggacagccagtcc；t2为第二个靶点gggatcgtgaggtactttgc。具体实施方式实施例11.crispr载体的构建以水稻品种“日本晴”测序序列设计靶定于目标基因的特异性引物，构建crispr载体。申请人首先利用lut2序列设计两个crispr靶标位点，并控制其靶标位点落在lut2基因外显子区域。将两个靶标接头分别与crispr/grna-u3和crispr/grna-u6a质粒链接，利用bsai限制性内切酶完整的将grna-u3和grna-u6a切下并共同连接到pylcrispr/cas9-mh载体上，得最终pylcrispr/cas9-mh–lut2质粒，并将终质粒转入日本晴愈伤组织中。继代、共培养后，获得oslut2基因编码区被敲除4个碱基的转基因苗，最终观察其npq(非光化学淬灭)表型，验证该基因在调控水稻光保护中的重要功能。试验中所用的遗传转化受体水稻材料是粳稻品种日本晴(oryza.satival.spp.japonica)，为常用品种。1.1基因组靶位点选择和双链接头设计1.1.1靶位点选择在目标区如果能够找到ngg上游第20个碱基是a(用u3启动子，序列见后所述)或g(用u6a启动子，序列见后所述)的序列(a，g分别为u3和u6a启动子的转录起始碱基)，优先选为靶序列的合成接头。如果在ngg上游第20个碱基不是a或g，可选20个碱基为靶序列合成接头。为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计两个靶点。例如在orf5`区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或将两个靶点之间的序列被敲除。靶点序列gc％偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个c/g(包括u6转录起始点g)。osu3启动子序列ctctggaatcggcagcaaaggacgcgttgacattgtaggactatattgctctaataaaggaaggaatctttaaacatacgaacagatcacttaaagttcttctgaagcaacttaaagttatcaggcatgcatggatcttggaggaatcagatgtgcagtcagggaccatagcacaagacaggcgtcttctactggtgctaccagcaaatgctggaagccgggaacactgggtacgttggaaaccacgtgtgatgtgaaggagtaagataaactgtaggagaaaagcatttcgtagtgggccatgaagcctttcaggacatgtattgcagtatgggccggcccattacgcaattggacgacaacaaagactagtattagtaccacctcggctatccacatagatcaaagctggtttaaaagagttgtgcagatgatccgtggcosu6a启动子序列ctctggaatcggcagcaaaggattttttcctgtagttttcccacaaccattttttaccatccgaatgataggataggaaaaatatccaagtgaacagtattcctataaaattcccgtaaaaagcctgcaatccgaatgagccctgaagtctgaactagccggtcacctgtacaggctatcgagatgccatacaagagacggtagtaggaactaggaagacgatggttgattcgtcaggcgaaatcgtcgtcctgcagtcgcatctatgggcctggacggaataggggaaaaagttggccggataggagggaaaggcccaggtgcttacgtgcgaggtaggcctgggctctcagcacttcgattcgttggcaccggggtaggatgcaatagagagcaacgtttagtaccacctcgcttagctagagcaaactggactgccttatatgcgcgggtgctggcttggctgcc1.1.2靶点特异性检查虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题，但是万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交(和回交)就可分离排除非特异打靶位点，但应该将候选靶序列+ngg(上下游加几十碱基)对目标基因组做blast，避免在靶序列的3`端+ngg与其它功能基因和基因组序列有相似性。但是打算用一个靶序列敲除两个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。根据以上规则申请人设计了如下所示序列的两对oslut2特异性靶点引物：lut2-u3-f：ggcagggatcgtgaggtactttgc，lut2-u3-r：aaacgcaaagtacctcacgatccc；lut2-u6a-f：gccggactggctgtccatggact，lut2-u6a-r：aaacagtccatggacagccagtc。1.2菌种活化和质粒提取制备将pylcrispr/cas9-mh(b)菌种(华南农业大学刘耀光课题组惠赠)(top10f)和crispr/grnavectors菌种dh10b(华南农业大学刘耀光课题组惠赠)分别在含有25μg/ml的卡那霉素和50μg/ml氨苄青霉素平板培养基划出活化单菌落，取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养，用于提取质粒。pylcrispr/cas9-mh(b)载体较大(约16.5kb)，拷贝数较低(pbr322复制子)，采用质粒小型柱提取纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒(如天根生化(北京)科技有限公司生产的endofreemaxiplasmidkit试剂盒)提取纯化。具体步骤如下(下面步骤(1)至(10)所用的试剂或缓冲液均来自该试剂盒自带的试剂)。具体步骤：(1)接种单克隆于500ml/1l相应抗性lb培养基中，于37℃振摇过夜(200-250rpm,16-18小时)。(2)用500ml离心管收集菌液，在5000g离心10min，尽量弃干净上清。(3)加入30ml溶液i(含rna酶100ug/ml)，震荡重悬混匀菌体。(4)加入50ml溶液ii，缓慢地上下翻转离心管约10次，室温放置10min。(5)加入40ml溶液iii(ph＝5.2)，混合均匀,冰浴10min.(6)在5000g4℃离心15min，miracloth过滤上清到一新的500ml三角瓶中。沉淀比较松散，用miracloth过滤可以获得很干净的上清，防止杂质堵塞qiagen-tip。如果没有miracloth，可以多次离心取上清，从而获得很干净的上清(7)将10mlbufferqbt加入到qiagen-tip100/500柱子中，依靠重力进行过滤，使过滤柱活化。(8)将第6步获得的上清缓慢流过qiagen-tip100/500的柱子，用10/30mlbufferqc洗涤qiagen-tip2次。(9)用15mlbufferqf溶解dna，再用50ml离心管收集。(9)加入10.5ml异丙醇，混匀后12000g，4度离心20min，弃上清。(10)加入5ml70％乙醇洗涤，12000g、4℃离心10min，弃上清，自然风干。100/500μltebuffer溶解，-20℃放置备用。1.3靶点接头制备将接头引物te溶解制成100μm的母液，各取1μl加入到98μl0.5xte混合稀释到1μm。约90℃30s，移至室温冷却，完成退火。1.4边切边连配制10μl1xbsai酶切连接反应液：在1xbsai-内切酶buffer中加入atp(三磷酸腺苷)至终浓度0.5-1.0mm，加入约20ngpylgrna-osu#质粒(预先配好20ng/μl保存)，0.5μl接头(最终浓度0.05μm)，5ubsai，35ut4dnaligase(该缓冲液(buffer)对bsai和ligase都有效)。如果实验室没有atp，在1x内切酶buffer中加入0.2-0.3μl10xnebt4dnaligasebuffer(10xnebt4dnaligasebuffer中含有10mmatp,但10x宝生物工程大连有限公司的t4dnaligasebuffer中含有1.0mmatp，因此优先使用neb公司的；或添加1μl10x宝生物工程大连有限公司的t4dnaligasebuffer)。用变温循环仪或pcr仪循环反应5个循环：37℃5min，20℃5min。1.5扩增grna表达盒1.5.1第一轮扩增取1μl连接产物为模板，使用引物u-f(见表1)/接头反向引物lut2-u3-r和lut2-u6a-r(即反应1)，和接头正向引物lut2-u3-f和lut2-u6a-f/grna-r(见表1)(即反应2)，各0.2μm,适量高保真pcr酶，最好使用kod-plus(购自toyobo公司)，保真度最高且性价比高，或kodfx，或takara公司的extaq。不要使用能在产物3`附加a碱基的taq酶，此a碱基使产物在第二轮pcr中不与互补链配对而不能延伸补平)。25-28循环：95℃10s，60℃15s，68℃20s。取4μl电泳检查(反应2产物长度约140bp用2％琼脂糖胶检测)。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮pcr。1.5.2第二轮扩增取第一轮pcr反应1、2产物1μl用h2o稀释10倍，各取1μl混合为模板。各表达盒20-50μlpcr(1个靶点50μl；2-3个靶点各30μl；4个或以上靶点各20μl)。加入1/10量每种引物组合工作液(最终浓度0.15μm)。使用适量kod-plus或其它高保真pcr酶。扩增15-20循环：95℃10s，58℃15s，68℃20s。取2-3μl电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。u3-grna利用混合引物pt1(b1`+b2)(见表1)；u6a-grna利用混合引物pt2l(b2`+bl)(见表1)来进行第二轮扩增。表1本发明所用标记引物序列1.6将grna表达盒链接终载体1.6.1扩增产物的纯化根据各样品产物量把所有产物等量混合，利用pcr产物纯化kit纯化试剂盒(购自天根生化(北京)科技有限公司)进行纯化。具体步骤如下：(1)在pcr反应液中加入3倍体积的bufferpcr-a，若需加入的bufferpcr-a不足100μl，则加入100μl。(2)将dna-preptube置于2-mlmicrofugetube中，将步骤⑴中的混合液移入dna-prep试管中，5500rpm离心1min。(3)弃滤液，将dna-prep试管置回到原2-mlmicrofuge试管中，加入500μlbufferw1，5500rpm离心1min。(4)弃滤液，将dna-prep试管置回到原2-mlmicrofuge试管中，加入700μl已加无水乙醇的bufferw2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的bufferw2洗涤一次。(5)弃滤液，将dna-prep试管置回到原2-mlmicrofuge试管中，14000rpm离心1min。(6)连滤液一并弃掉收集管，将dna-prep试管置于一新的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25-30μleluent或去离子水(65℃预热)。(7)室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱dna1.6.2纯化产物连接终载体取约20ng纯化产物，加入约60ng未切割的pylcrispr/cas9-mh(b)质粒(预先稀释成约100ng/l冷冻保存)，在15μl反应(1xbsai-内切酶buffer)用10ubsai37℃酶切10min(不要过多bsai和过长时间，否则载体会产生破坏平滑末端而自连)。加入atp至终浓度1.0mm。用变温循环酶切连接15循环:37℃2min；10℃3min，20℃5min；最后37℃2min。该方法要点在于：由于没有去除bsai切出的13/17碱基小片段和ccdbs片段，它们会被竞争连接回原来的位置。此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被bsai切除，而连接好的目标产物序列由于不存在bsai的识别位点不会被切断。1.7电激法转化将连接产物滴载在悬浮式透析膜milliporevswp04700(孔径为0.025μm)对1/5xte透析15-30min(最好在4℃冷柜内)脱盐(或用乙醇沉淀，70％乙醇洗，风干溶在5μl去离子水)，取1-1.5μl连接产物电激转化大肠杆菌(e.coli)dh10b感受态细胞(虽然其它菌株也可以用，但dh10b更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用sob培养基(成分见后)培养(不要用lb培养)。电激后加入1mlsoc培养基为lb+25μg/ml的卡那霉素，0.3-0.5mmiptg(使用laciq基因型菌种用1.0mm)，适量x-gal。iptg诱导没有彻底切除ccdbs的空载质粒转化子的ccdbs表达致死。而含有目标插入序列(lacz-osu3-grna表达盒)的阳性克隆由lacz表达产生蓝色菌斑。1.sob(superoptimalbroth)培养基配制每升培养基，在950ml去离子水中加入：胰化蛋白胨20g；酵母提取物5g；nacl0.5g；摇动容器使溶质完全溶解。加10ml250mmol/lkcl溶液(将1.86gkcl用100ml去离子水溶解即配成250mmol/lkcl溶液)。用5mol/lkoh调ph值至7.0。用去离子水定容至1l。在121℃高压蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2mol/lmgcl2[2mol/lmgcl2溶液的配制方法如下：用90ml去离子水溶解19gmgcl2，用去离子水调整体积为100ml，在121℃高压下蒸汽灭菌20min]。2.soc(superoptimalbrothwithcataboliterepression)培养基soc培养基除含有20mmol/l葡萄糖外,其他成分与sob培养基相同.sob培养基经高压灭菌后冷至60℃或60℃以下,加20ml除菌的1mol/l葡萄糖溶液即可。2.农杆菌介导的水稻转化2.1试剂及培养基1.kt(kinetin)，公司/货号sigmacatno.k-0753；2.6-ba(6-benzylaminopurine)，公司/货号sigmacatno.b-5898；3.iaa(indole-3-aceticacid)，公司/货号sigmacatno.i-5148；4.naa(napthaleneaceticacid)，公司/货号sigmacatn-0640；5.2,4-d(2,4-dichlorophenoxyaceticacid),公司/货号sigmacatno.d-8407；6.ch(caseinenzymatichydrolysate),公司/货号sigmacatno.c-7290；7.kanamycin，公司/货号usbcatno.17924；8.cn(carbenicillin),公司/货号gibcobrlcatno.10177-012；9.hn(hygromycinb),公司/货号gibcobrlcatno.10687-010；10.as(acetosringone),公司/货号aldrichchem.,co01531eg；11.pyridoxinehcl，货号sigmacatno.p-8666；12.nicotinicacid，公司/货号sigmacatno.n-0765；13.inositol，公司/货号sigmacatno.i-3011；14.thiaminehcl，公司/货号sigmacatno.t-3902；15.phytagel，公司/货号sigmacatno.p-8169；16.dimethylsulfoxide-dmso，公司/货号sigmacatno.d-5879；17.x-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-d-galactoside),公司/货号sigmacatno.b-3783；18.ms大量元素(msmax)储备液(10倍体积，倍体积简写为x，下同)nh4no316.5g；kh2po41.7gkno319.0gmgso4·7h2o3.7gcacl23.32g或cacl2·2h2o4.4g逐个溶解，然后加dh2o到1000ml。19.ms微量元素(msmin)储备液(100x)mnso4·4h2o2.23g；znso4·7h2o0.86g；ki0.083g；h3bo30.62g；na2moo4·2h2o0.025g；cocl2·6h2o0.0025g；cuso4·5h2o0.0025g；注：na2moo4必须单独溶解，再与其它组分混合，补充dh2o定容至1000ml；室温保存。20.n6大量元素(n6max)储备液(10x)kno328.3g；(nh4)so44.63g；kh2po44.0g；mgso4·7h2o1.85g；cacl21.25g；或cacl2·2h2o1.66g；逐个溶解，然后加dh2o定容至1000ml。21.n6微量元素(n6min)储备液(100x)ki0.08g；h3bo30.16g；znso4·7h2o0.15g；mnso4·4h2o0.44g；或mnso4·h2o0.3335g；用dh2o定容至1000ml；室温保存。22.fe2+-edta储备液(100x)往一个试剂瓶中加入300mldh2o和feso4·7h2o2.78g，再往另一试剂瓶中加入300mldh2o，并加热到70℃，然后加入na2edta·2h2o3.73g，都溶解好后，将两个瓶中的溶液混合，在70℃保温2小时，然后加dh2o定容至1000ml；4℃避光保存。23.维生素(vitamin)储备液(100x)nicotinicacid0.1g；thiaminehcl(vb1)0.1g；pyridoxinehcl(vb6)0.1g；inositol10g；glycine0.2g；加dh2o定容至1000ml；4℃保存。24.aamax储备液(10x)kcl29.50g；mgso4·7h2o2.50g；nah2po41.50g；cacl2·2h2o1.50g；加dh2o定容至1000ml；室温避光保存。25.aamin储备液(100x)mnso4·h2o1.0g；znso4·7h2o0.2g；cuso4·5h2o0.0025g；h3bo30.3g；ki0.075gcocl2·6h2o0.0025g；namoo4·2h2o0.025g；将na2moo4单独溶解，然后与其它组分混合并加dh2o定容至1000ml；室温避光保存。26.6-ba储备液(1mg/ml)6-ba100mg；加入1.0ml1n的koh振摇至6-ba溶解，然后加dh2o定容至100ml；室温保存。27.kt储备液(1mg/ml)kt100mg；加入1.0ml1n的koh振摇至kt溶解，然后加dh2o定容至100ml；室温保存。28.2,4-d储备液(1mg/ml)2,4-d100mg加入1.0ml1nkoh振摇5min，然后加10mldh2o并振摇至2,4-d溶解，用dh2o定容到100ml，室温保存。29.100mmas储备液as0.196g；dmso10ml；用1.5ml离心管分装；4℃保存。30.iaa储备液(1mg/ml)iaa100mg；加入1.0ml1n的koh振摇至iaa溶解，然后用dh2o定容至100ml；室温避光保存。31.naa储备液(1mg/ml)naa100mg；加入1.0ml1n的koh振摇至naa溶解，再用dh2o定容至100ml；室温避光保存。32.1n的koh储备液koh5.6g；用100mldh2o溶解；室温保存。33.0.15％的hgcl2溶液配制hgcl21.5g；先用1ml无水乙醇部分或完全溶解hgcl2，再用dh2o定容至1000ml；搅拌4-8小时培养基配方：诱导培养基继代培养基预培养基共培养培养基悬浮培养基筛选培养基分化培养基生根培养基2.2愈伤组织的诱导在一个100ml的三角瓶中倒入40-50ml的无菌的诱导培养基；在超净工作台中将水稻种子剥掉颖壳，先用75％浓度的乙醇浸泡1min(时间不能过长)，再用0.15％浓度的hgcl2溶液浸泡15-25min，最后用无菌水清洗5-10次，备用；每瓶培养基接入8～12颗种子，在室温暗培养下经40～50天诱导产生愈伤组织。2.3继代培养提前2-3天配制继代培养基，灭菌，使培养基干燥(太湿的培养基不利于愈伤组织的生长)。从诱导的愈伤组织中，挑淡黄色，颗粒状，干燥，且活力强的愈伤组织转入继代培养基中室温暗培养20d；最好继代一次后做侵染，每一个愈伤组织最多继代两次，否则愈伤组织转化效率降低，第一次继代时注意将愈伤组织上附着的其他组织如胚乳或芽等去除干净。2.4预培养提前用500ml三角瓶准备适量无菌预培养基试验前每250ml培养基中加入300μlas(acetosringone)，5ml40％葡萄糖并倒皿，每瓶倒培养基可配置8～10个培养皿；从继代愈伤组织中，挑去淡黄色，颗粒状，干燥，且活力强的愈伤组织转入预培养基中，通常每个皿接种60-80块左右绿豆大小的愈伤组织，愈伤组织较大可用镊子夹碎，室温暗培养3d。2.5侵染与共培养农杆菌转化的受体是水稻品种“日本晴”。用含有crispr载体pylcrispr/cas9-mh-lut2(见附图6)和pylcrispr/cas9-mh空载体(见图5)的eha105的菌液侵染“日本晴”种子诱导得到的愈伤组织。“日本晴”愈伤组织经eha105菌液侵染后，于19℃避光共培养2d，水洗，避光，28℃下培养15d进行第1次筛选，将筛选出的抗性愈伤组织避光于28℃下再培养15d进行第2次筛选，直到长出亮黄色的抗性愈伤组织。将1个片段转化的愈伤组织共有10个培养皿(直径9cm)，每个培养皿上有25粒愈伤组织。分化培养一段时间得到再生植株，即为t0代转基因苗。3.t0代转基因再生植株的阳性检测利用常规的ctab法抽提转基因植株基因组dna，作为pcr模板。通过扩增筛选标记引物(见表1)来检测转基因阳性植株，所用的标记引物见表1中cas9引物。pcr产物大小为750bp。20μl的pcr反应体系，包含：20-50ngdna模板,10mmtris-hcl,50mmkcl,0.1％tritonx-100,1.8mmmgcl2,0.1mmdntp,0.2μm引物和1urtaqdnapolymerase。pcr扩增的条件：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，34个循环；72℃延伸至10min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶检测。检测结果见图1。除了lut21-4、lut21-8、lut22-1、lut22-5、lut22-6五株为阴性以外，其余的转基因植株全为阳性。并用表一中oslut2-cx-f/r引物测序检验。4.叶绿素荧光参数的测定npq(非光化学淬灭)等荧光相关值的测定是采用德国walz公司制造的pam-2500叶绿素荧光仪。具体测量步骤参照该仪器的使用说明书，包括如下步骤：在实验室配制0.01％的琼脂糖作为叶片存放缓冲液；田间取水稻的剑叶叶片样品组织置于缓冲液中，将样品暗处理2h以上；避光过程中用2030-b叶夹夹住叶片中部，使用pam-2500进行测量。对上述lut2的crispr材料的npq数据(表2和表3)进行比较，发现转基因阳性植株的npq值明显低于转基因阴性植株。表明lut2基因利用crispr技术敲除后植物的光保护能力有显著性下降，证明lut2基因对水稻的光保护过程起到一定的调控作用。表2lut2转基因阳性植株各个植株的npq值表3lut2转基因阴性植株各个植株的npq值idfv/fmnpqlut21-40.8252.730lut21-80.8202.882lut22-10.8192.862lut22-50.8362.447lut22-60.8242.849综上所述，本发明基于现有技术问题，重点研究了整个oslut2基因的功能，利用crispr技术敲除掉这个基因编码区的四个碱基，使得整个基因的功能丧失，其中在3745bp长的序列的第388-407；1894-1913区段是该基因特异性靶标位，靶点的选择就是选择这个基因编码区序列，并且有ngg+nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn+a/g的位点，利用crispr技术敲除了这个基因后，观察其光保护表型，发现oslut2基因敲除后水稻的光保护能力下降了(见图3和表2和表3)，选择这两个靶点就是因为在oslut2序列中这两个位置的序列满足ngg+nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn+a/g的要求，利用crispr技术的最终目的是的是得到oslut2基因被敲除的植株，因而设计这两个靶点是为了提高打靶效率。申请人设计的第一个靶点时并没有打靶成功，也没有产生碱基缺失。申请人设计的第二个靶点成功打靶并导致4个碱基的缺失，直接影响oslut2蛋白的正常翻译。oslut2(以npq值即(非光化学淬灭)来衡量)有显著性下降，证明oslut2基因对水稻的光保护过程起到一定的调控作用。序列表<110>华中农业大学<120>oslut2基因在水稻光保护中的应用<141>2017-12-09<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>3745<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<220><221>gene<222>(1)..(3745)<220><221>mutation<222>(1908)..(1911)<220><221>mutation<222>(1894)..(1913)<220><221>mutation<222>(388)..(407)<400>1cagcagccagcagcagacgcagagaccagtagctttcgcagaggcggcagccaccaccgc60ctcctcctcctcctcctcatccgacggtgtgcaaccaagcgatggagttctccggcggcg120cgaccgtgtcggcgccgttcggttgctgccgtgcggcgtggggcgccgcggcggcgggtg180cgggggcggagggaaggagcaggagggttgtgccgcgcgcggtggagccgcggcggcgcg240ggcggtggatggtgaggtgcgtggcgacggagaagcacaaggacgcggcggcgcggcgcg300gcggcgtggaggtggagttcgccgacgaggaggactacgtcaagggcggcggcggcgagc360ttctctacgtgcaaatgcaggcgtccaagtccatggacagccagtccaagatctcctcca420aggtaggaggagtagcagtaaataaatcatatcactactccaattttttttgtttgttta480tgcatgcctagatgatcttgattttagcagttaattagcattatgcaaggtcgagatctg540gctttatacaaaacccacaatcaccttgctgccatggttgccgtttacaagaaagaatca600aacacgaaattcatcaacagcatgaatgaaacactgttgcatcgccctgatcacgcgcgt660gctacgacgacgggtgtggaatgttgattcacgtgatgctatcacgaattcactccatat720cttgaccaaaaaaaaaaaaagagcagcctctggttgcccatgcttgctgctgcctgccat780atctctgtggagcttggactattctccatgtctcctgtaatgggagctcacgtcgtcgcc840tgtacaaaaggtgttaattaggggataagttaagagtatctcatactgttctcaactcaa900ctgctgactaattacaccttcggatgcaacttggaacgtactgttgcattaattattgtc960tgcttgcaaatttctcagagatgttgaatttgatgaagtgtacgtgcgtcgcatttgcag1020tccaacatcacacctttgacttgatgtgattcaagcaacaagtgaagtgctaggctaaac1080acaagcacagttccccgaaatcatgccatttattcttgacacatggacatcctggaaatt1140gttcaaagtttctagactgctaggaatgcgaataacttgtactgaacttttgaaacattt1200ttgtcagcccaatcaggattttttttagtttatttcctgaaactctgcattggaacgaat1260aaataaatggtgtctcaagaaaataaagcacgtgctctgaatctttgtgtgcagctgctg1320cccatacccgatgaaaattcagttcttgatttggtcatcattggctgcggtccagctggc1380ttatccctagcagcagagtcagctaagaaagggctcaatgttggtctcattggccctgat1440cttccattcacgaacaactacggtgtgtgggaggatgaattcaaaggtagcatactattt1500tcagcactgaataacattgttgccatcataatttggtacatgatggacttatggctcttg1560atcttttgctatccagacctgggcctggagagctgcattgaacatgtctggaaggatact1620atcgtgtacctagacggtaacaagccaataatgattggccgtgcgtatggcagggttcac1680agggacttgctgcacgaggagttgctgagacggtaaattttcagttagcaatcttgagag1740taaacagagtcaggcaaagtgatacaaaattattgatgaaaaattatactctaaaaactg1800tcagatgctatgacgctggcgtcacatacctcagctcgaaggtggacaagatcatggaat1860ctcctgatggacatcgggtagtctgttgtgaaggggatcgtgaggtactttgcaggcttg1920ccattgttgcatctggggcagcatctggtaggcttctagagtacgaggttggtggtccgc1980gtgtttgtgtgcagactgcatatggtgtcgaagtcgaggtatgcacaactcctatagaac2040ttactcccctcgagagtttagaatagtttcccttctgtcgtcgtgtttctacgagcattt2100tattcatattgtttcaagctgaaaattttagatatgttatttgggcacatgtcattcatc2160tttcacaatgatttgaaaattttcaggtggaaaacaatccatatgatcccagcttaatgg2220ttttcatggactacagagattgcttcaaagacaaattctcacatcctgagcaaggaaatc2280caacgttcctctatgccatgcccatgtcatccacacgaattttctttgaggtccatatga2340gaaactttatcacaatttattcctccgactagtattttcccatgcttttgtgttgctgat2400gataattatttcaagacaggaaacatgcctagcttctaaagaagcaatgccctttgacct2460ccttaaaaagcggttgatgtctcggttggatgcaatgggagttcatattcgaaaagtata2520cgaggaggtaacaagttatggcttggtgtcactagttgtttctcttgcataggtgaagtg2580gaaacttaacctaaatgctgaactcttgatttcaggaatggtcctacattcctgttggag2640ggtccttaccaaatacagaccagaaaaatctcgcatttggtgcggcagcaagtatggtgc2700atcctgcaaccggtactaacaaatcctcaatccgtactttcaatttctcttgtatttaca2760ggcaataatataatatttatctgtcaaaaacataggatactcggtggttagatcattgtc2820tgaagctccaagatatgcatctgtgatatctgatatcttgagaaaccgtgtctaccctgg2880agaatatttgcctggaacctctcaaagttccagtccatcaatgcttggtaagcattcttc2940tgatatttattcaattttattgacaagcacaccagtattacaaattggagtacattgctt3000cagatgagggcagtattttagtataattttggaaatgtcaggaacattttctggtactaa3060ttgctatgcggtgttgcagcatggagaacattatggccccaagaacggaaacgtcaacga3120tcattcttcctttttgggctggctttgataatccaactgaataacgaaggcattcagaca3180ttctttgaaacctttttccggttgcccaaatggtaattctactcttgattgcatttgcct3240ctgttttcagtctatttacaaataccattatgtatgacctgaagattgccacccaacaaa3300gtgttcatcactgttctttgttactatcaggatgtggcgaggattccttggttcgacgct3360ttcttcagtggatctcatactctttgcattctacatgttcacaattgcgccgaaccaaat3420gcgaatgaaccttgtcagacatctcctctctgatccgaccggctcaacgatgatcaagac3480ctacctgaccttgtaaaaccatttcagcagtctacaagaatattaggaaatgtacagttt3540tgtagtttgtacataacatagtgagagccagaggatatgggggttggggggttacttatc3600atgctagaacaacaaaacactgcaagaattttatgcatgaatttggcaaatggaatagat3660tatgcagaatgggaacacgtgaatacgtgatgcgtgtgctggaacaacaagtaggaggaa3720taaaacccatggattatggatcttg3745当前第1页12