一种产核酸的热带假丝酵母菌及其制备方法与流程

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产核酸的热带假丝酵母菌及其制备方法。

背景技术：

许多报道表明，膳食来源的核苷酸对维持细胞免疫反应和婴儿的发育都非常重要。同时，核苷酸能促进幼鼠的肠道生长和成熟。在水产养殖方面，除了饮食的适口性、诱食性和非必需氨基酸的生物合成外，外源性核苷酸作为膳食补充剂，已显示出其能提高水产养殖鱼类的免疫力和抗病能力。酵母核酸的降解产物核苷酸不仅具有抗氧化、抗衰老、降低胆固醇的作用，还具有提高体内铁和蛋白利用率的作用。

通过酵母发酵法制备核苷酸是目前工业生产的主要方法。该方法可以采用热带假丝酵母通过优化发酵工艺等方式提高热带假丝酵母的核酸含量。但是，在制备时发现其核酸含量只能提高至13％左右，该含量仍较低有待进一步提高。

技术实现要素：

为了解决现有技术中制备的核酸含量较低的问题，本发明实施例提供了一种产核酸的热带假丝酵母菌及其制备方法。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种产核酸的热带假丝酵母菌，所述产核酸的热带假丝酵母菌于2017年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017820。

另一方面，本发明实施例提供了一种产核酸的热带假丝酵母菌的制备方法，所述方法包括：

将热带假丝酵母菌hy4-17-21作为初始菌株，通过电子束诱变得到所述产核酸的热带假丝酵母菌。

具体地，采用最大能量为2.0mev，功率为50kw，且辐照剂量为0.4-1kgy的电子束进行诱变。

进一步地，采用能量为1.8mev的电子束进行诱变。

进一步地，所述制备方法还包括：对所述热带假丝酵母菌hy4-17-21进行活化培养、发酵后的所述热带假丝酵母菌hy4-17-21再进行电子束诱变。

更进一步地，采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基所述热带假丝酵母菌hy4-17-21进行活化培养，所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基包括：葡萄糖、酵母提取和蛋白胨，葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的质量比为2:1:2。

更进一步地，所述发酵在发酵培养基中进行，所述发酵培养基包括：蔗糖、酵母提取物、硫酸铵、硫酸锌、硫酸镁和硫酸亚铁，蔗糖、酵母提取物、硫酸铵、硫酸锌、硫酸镁和硫酸亚铁的质量比为1000:1000:100:3:25:2.5，且所述发酵培养基的ph值为4。

更进一步地，将电子束诱变后的所述热带假丝酵母菌hy4-17-21经过初筛和复筛后，得到所述产核酸的热带假丝酵母菌。

再进一步地，所述初筛在初筛培养基中进行，所述初筛培养基包括：葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨和琼脂，葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨和琼脂的质量比为10:5:10:1，所述初筛的条件为30℃并于180rpm下培养，所述初筛的条件为30℃培养6h；

所述复筛在复筛培养基中进行，所述复筛培养基包括：蔗糖、酵母提取物、硫酸铵、硫酸锌、硫酸镁和硫酸亚铁，蔗糖、酵母提取物、硫酸铵、硫酸锌、硫酸镁和硫酸亚铁的质量比为1000:1000:100:3:25:2.5，且所述复筛培养基的ph值为4，所述复筛的条件为180rpm下于30℃中培养6h。

再进一步地，将经过电子束诱变后的菌株通过生理盐水稀释至10⁵～10⁶倍后，再进行筛选。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的产核酸的热带假丝酵母菌是以热带假丝酵母菌hy4-17-21作为初始菌株，通过电子束诱变所得，本发明实施例提供的产核酸的热带假丝酵母菌其核酸产量可达20.8％，相比于初始菌株提高了25.9％，该产核酸的热带假丝酵母菌是目前报道的核酸产量最高的菌株。

本发明实施例提供的热带假丝酵母菌于2017年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学，该热带假丝酵母菌分类命名分别为：candidatropicalishy4-17-21；保藏编号分别为：cctccno:m2017820。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的产核酸的初始菌株的形态图；

图2是本发明实施例提供的产核酸的热带假丝酵母菌的形态图；

图3是本发明实施例提供的标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例提供的试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

本发明实施例提供了一种制备产核酸的热带假丝酵母菌的方法，该方法包括：

活化：将热带假丝酵母菌hy4-17-21(该热带假丝酵母菌hy4-17-21来源于天津市工业微生物研究所菌种中心)作为初始菌株进行活化培养，该初始菌株的形态如图1所示。具体地，采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基进行活化培养，该酵母浸出粉胨葡萄糖培养基包括：浓度为20g/l的葡萄糖、浓度为10g/l的酵母提取和浓度为20g/l的蛋白胨，将配好的该酵母浸出粉胨葡萄糖培养基经过1×10⁵pa灭菌15min后待用。将热带假丝酵母菌hy4-17-21接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，活化条件为：30℃，摇床转速为180±20rpm。

发酵：将活化后的热带假丝酵母菌hy4-17-21按照1％的接种量接种至发酵培养基中，该发酵培养基包括：浓度为20g/l的蔗糖、浓度为20g/l的酵母提取物、浓度为2g/l的硫酸铵、浓度为0.06g/l硫酸锌、浓度为0.5g/l的硫酸镁和浓度为0.05g/l的硫酸亚铁，将发酵培养基的ph值通过磷酸调至4，经过1×10⁵pa灭菌15min后待用。发酵条件为30℃/180rpm培养至热带假丝酵母菌hy4-17-21生长到对数期。

在判断热带假丝酵母菌hy4-17-21的生长曲线测定时，在不同的培养时间分别取200μl的发酵培养液，以发酵培养基作为空白对照，在562nm处测定od值，当od值为600时，则热带假丝酵母菌hy4-17-21生长至对数期。同时，使用血球计数板对生长到对数期的菌株计数，确定电子束辐射前菌群初始细胞密度，在本实施例中，初始细胞密度为每毫升1×10¹¹个细胞。

诱变：将发酵后的热带假丝酵母菌hy4-17-21通过电子束诱变，诱变条件为：采用最大能量为2.0mev，功率为50kw，且辐照剂量为0.4-1kgy的电子束进行诱变。本实施例中的能量可以为1.8mev。具体地，待发酵后的热带假丝酵母菌hy4-17-21生长至每毫升1×10¹¹个细胞时，装入已经灭菌的透明培养袋中密封进行辐照。

优选地，辐照剂量为0.5kgy。该辐照剂量下能够保证正突变多于负突变，并有助于提高核酸的含量。

稀释：将诱变后的菌株采用通过生理盐水稀释至10⁵～10⁶倍后进行筛选。

优选地，通过生理盐水稀释至10⁶倍后进行筛选。经0.5kgy辐照剂量的电子束辐射处理后稀释10⁶倍后平均存活26个单菌落，挑选的菌落要求形态较均一，且为乳白色球状，大小与初始菌株相近。

筛选：筛选包括初筛和复筛，初筛时，初筛在初筛培养基中进行，该初筛培养基包括：浓度为20g/l的葡萄糖、浓度为10g/l的酵母提取物、浓度为20g/l的蛋白胨和浓度为2g/l的琼脂。初筛的温度为30℃，初筛的培养时间6h，将经过初筛培养后的菌落进行复筛培养，复筛在复筛培养基中进行，复筛培养基包括：浓度为20g/l的蔗糖、浓度为20g/l的酵母提取物、浓度为2g/l的硫酸铵、浓度为0.06g/l硫酸锌、浓度为0.5g/l的硫酸镁和浓度为0.05g/l的硫酸亚铁，复筛培养基的ph值为4，且复筛的条件为180rpm下于30℃中培养6h。

复筛后得到产核酸的热带假丝酵母菌，该产核酸的热带假丝酵母菌于2017年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017820。同时，该产核酸的热带假丝酵母菌于600倍的光学显微镜下的细胞形态如图2所示，由图2可知，该产核酸的热带假丝酵母菌的形态为椭圆状或球状。

制备标准品：称取rna标准品5.0mg，用少量浓度为0.05mol/l的氢氧化钠溶液浸透rna标准品，并将rna标准品研磨至糊状，从而形成浑浊液，向浑浊液中加入3ml无菌水并混匀，将调节ph值至7.0后；再用无菌水定容至5ml，得到母液。该母液的rna质量浓度为1mg/ml。配置标准品溶液：将母液用无菌水分别稀释1000、200、100、50和20倍，再用酶标仪测定od260值，并绘制标准曲线图，该标准曲线图如图3所示，具体为y＝0.02x+0.0063，r²＝0.9994，通过该标准曲线图及标准品rna纯度确定1ml/mg的rna标准品的光吸收值，在本实施例中，1ml/mg的rna标准品的光吸收值为26l/(g·cm)。

核酸含量测定：取2ml对数中期的热带假丝酵母菌hy4-17-21分别置于a和b两个试管中，以4000r/min离心10min，将a试管置于80℃的烘箱中烘干称重；将b试管中的上清倒掉，向b试管中加入1ml生理盐水进行重悬，以4000r/min离心10min，将上清液尽量取干净，再向b试管中加入浓度为10％的高氯酸2ml，并将b试管置于70℃的水浴锅中加热20min，期间每隔4-5min上下颠倒b试管进行混匀，加热结束后将b试管置于冰上进行冷却，冷却后以10000r/min离心10min，取上清液用无菌水稀释50倍，同时，用无菌水稀释50倍的浓度为10％的高氯酸作为空白对照，采用酶标仪在260nm处测定核酸的吸光度。

根据公式rna含量(％)＝(a×50×2)/(m×26)×100％，式中：a为od260，50为稀释倍数，2为高氯酸的体积(ml)，m为2ml菌液所得的菌体干重，26为1ml/mgrna标准品的光吸收值。得到rna含量为20.8％。

蛋白含量测定：产核酸的热带假丝酵母菌在发酵培养基中30℃培养30h，取20ml菌体置于离心管中，以6000r/min离心10min，倒掉上清液后，将离心管于-80℃冷冻处理2h，并置于冷冻干燥机中12h后称重，并研磨至粉末状，称取0.2g粉末用凯氏定氮法测定粗蛋白含量。测得粗蛋白含量为60.4％。

本发明实施例提供的产核酸的热带假丝酵母菌是以热带假丝酵母菌hy4-17-21作为初始菌株，通过电子束诱变所得，本发明实施例提供的产核酸的热带假丝酵母菌其核酸产量可达20.8％，相比于初始菌株提高了25.9％，该产核酸的热带假丝酵母菌是目前报道的核酸产量最高的菌株。同时，该产核酸的热带假丝酵母菌其蛋白产量可保持在60.4％，在提高核酸产量的同时，蛋白产量未降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。