一种双发射荧光纳米粒的制备方法与流程

本发明属于纳米制备技术领域，具体涉及一种双发射荧光纳米粒的制备方法。

背景技术：

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)是由乳酸和羟基乙酸按照一定比例聚合而成的高分子材料，其降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人体代谢产物。由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性、质量稳定、降解速度可调节性，近年来被大量用作微纳米控释、靶向系统的载体材料。

为表征纳米粒在细胞或体内的行为，通常会采用纳米粒包载一定量的荧光染料，从而示踪该纳米粒的转运、分布行为，然而细胞或体内环境复杂，当纳米粒发生包载物释放后，这种方法只能够反映包载物在细胞或体内的分布行为，不能够反映纳米粒载体的分布行为，难以评价微纳米控释、靶向系统的性能。通过对纳米粒载体材料和包载物的双荧光标记可实现对整个纳米粒在细胞或体内性能的评价。

罗丹明b是一类以氧杂蒽为母体的碱性呫吨类染料，具有螺环和开环的互变分子结构，是一类具有强荧光，高激光输出效率的染料，染料的发色团中两个苯环间“氧桥”相连，碳原子与氧原子处于对位，形成一个六元环，分子具有刚性平面结构，使其稳定性增强，容易吸收光而发射长波，从而形成荧光，且能减少分子内的热运动，减少激发态能量损耗，提高荧光发射效率，其在醇溶液中为红色荧光，最大吸收波长552nm，最大荧光波长610nm。由于罗丹明b水溶性好，具有较高的消光系数，较高的荧光良子产率，无毒，容易制备等优点，被广泛应用于分析、生物和医药等领域。

目前尚无关于将罗丹明b化学键合在plga上，使plga能够在一定的激发波长下发射荧光，并用于制备双荧光纳米粒的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双发射荧光纳米粒的制备方法，该方法利用化学合成方法将荧光染料罗丹明b化学键合在生物材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物上，使其受到光激发后能够发射荧光，通过使用该材料包载荧光染料香豆素6，进而制备得到能够发射双荧光的纳米粒。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种双发射荧光纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温反应10～12小时，得到反应液a；将乙二胺的二氯甲烷溶液滴加到反应液a中，室温反应18～24小时，反应结束后，洗涤，过滤，干燥，得到中间体b；

(2)将罗丹明b与1-羟基苯并三唑溶解于无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入三乙胺，搅拌均匀后，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应8～10小时，得到反应液c，将中间体b的二氯甲烷溶液滴加到反应液c中，避光、室温反应18～24小时，反应结束后，洗涤，过滤，干燥，得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

(3)将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6溶解于二氯甲烷中，然后加入到聚乙烯醇水溶液中，得到混合液d，将混合液d在室温、避光搅拌4～6小时，离心、洗涤、干燥，得到双发射荧光纳米粒。

本发明进一步的改进在于，步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物与n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的总量的比为150～250mg：85～142mg，n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:(20～25):(1.5～2.0)。

本发明进一步的改进在于，步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙二胺的摩尔比为1:(9～11)。

本发明进一步的改进在于，步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液与乙二胺的二氯甲烷溶液的体积比为5:2。

本发明进一步的改进在于，步骤(2)中罗丹明b、1-羟基苯并三唑、三乙胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为3:3:(10～30):8。

本发明进一步的改进在于，步骤(2)中中间体b与罗丹明b的摩尔比为1:3，中间体b的二氯甲烷溶液与罗丹明b与1-羟基苯并三唑的无水二氯甲烷溶液的体积比为1:2。

本发明进一步的改进在于，步骤(3)中罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的摩尔比为1:1。

本发明进一步的改进在于，将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6溶解于二氯甲烷中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为15mg/ml。

本发明进一步的改进在于，步骤(3)中罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶与聚乙烯醇水溶液的体积比为1:4；聚乙烯醇水溶液的浓度为1g/100ml。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的荧光剂修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物材料的合成方法，通过引入中间连接分子乙二胺，利用其两个末端氨基分别与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的末端羧基和罗丹明b的羧基发生化学缩合反应形成酰胺键，从而制备得到化学共价键修饰的荧光生物材料，即罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。本发明利用化学合成技术，将罗丹明b化学键合在聚乳酸-羟基乙酸共聚物上，对其进行结构修饰，使原本不具备光学特性的高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物能够吸收特定波长的光激发后，发射红色荧光，成为一种功能性高分子材料。

本发明提供的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物材料的合成方法，原料简单易得、价格低廉、反应条件温和，且不影响原料的光学、理化和生物学性能，制备得到的荧光生物材料稳定性好，荧光效果显著，具有良好的应用前景。

本发明提供的荧光剂修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物材料制备双荧光纳米粒的方法，将制得的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6溶解于二氯甲烷中，采用超声乳化、去除溶剂固化形成以荧光生物材料包载荧光剂香豆素6的双发射荧光纳米粒。罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为纳米粒的载体，受到特定波长的光激发后发射红色荧光，包载的香豆素6受到光激发后发射绿色荧光，因而可通过监测不同波段的荧光，实现整个纳米粒在细胞内或动物体内的性能评价。该方法制得的纳米粒检测灵敏度高、粒径分布均匀，不仅能够监测纳米粒包载物的释放、分布行为，还可监测纳米粒载体的降解和分布行为，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子结构式；

图2为实施例2制得的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的荧光光谱图；

图3为实施例2制得的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物在自然光下的稳定性研究结果；

图4为实施例6制得的双发射荧光纳米粒的荧光显微镜图；其中，(a)为纳米粒发射绿色荧光，(b)为纳米粒发射红色荧光，(c)为绿色、红色荧光合成图；

图5为实施例6制得的双发射荧光纳米粒的透射电镜图；

图6为实施例6制得的双发射荧光纳米粒的粒径分布图。

具体实施方式

结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明包括以下步骤：

(1)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温反应10～12小时，得到反应液a；将乙二胺的二氯甲烷溶液滴加到反应液a中，室温反应18～24小时，反应结束后，对反应体系依次进行洗涤、过滤，减压干燥，得到乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，即中间体b；

其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的总量的比为150～250mg：85～142mg，n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:(20～25):(1.5～2.0)；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙二胺的摩尔比为1:(9～11)；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液与乙二胺的二氯甲烷溶液的体积比为5:2。

(2)将罗丹明b与1-羟基苯并三唑溶解于无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入三乙胺，搅拌均匀后，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应8～10小时，得到反应液c，将中间体b的二氯甲烷溶液滴加到反应液c中，避光、室温反应18～24小时，反应结束后，对反应体系依次进行洗涤、过滤，减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

其中，罗丹明b、1-羟基苯并三唑、三乙胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为3:3:(10～30):8。

中间体b与罗丹明b的摩尔比为1:3，罗丹明b的无水二氯甲烷溶液与中间体b的二氯甲烷溶液的体积比为2:1。

(3)将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6溶解于二氯甲烷中，按照体积比为1:4将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的二氯甲烷溶液加入到浓度为1g/100ml的聚乙烯醇水溶液中，得到混合液d，对混合液d依次进行均质处理1～2分钟、超声处理2～3分钟、室温、避光搅拌4～6小时、离心、洗涤、干燥，得到双发射荧光纳米粒。其中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的摩尔比为1:1。罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的二氯甲烷溶液中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为15mg/ml

下面为具体实施例。

实施例1罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的合成

聚乳酸-羟基乙酸共聚物150mg完全溶解于8ml二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入3.8mgn-羟基丁二酰亚胺、110μl三乙胺和6.2mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，逐渐升温至室温反应10小时，得到反应液a，将5μl乙二胺加到3.2ml二氯甲烷溶液、混合均匀，然后将乙二胺的二氯甲烷溶液逐滴加到反应液a中，室温反应20小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，得到中间体b(乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物)；

将7.1mg罗丹明b和2.0mg1-羟基苯并三唑完全溶解于8.5ml无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入20μl三乙胺，搅拌均匀后，加入7.6mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应8小时，得到反应液c，将100mg中间体b完全溶解于4.2ml二氯甲烷中，得到中间体b的二氯甲烷溶液，将此溶液逐步滴加到反应液c中，避光、室温反应20小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水、2mol/l的盐酸溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

实施例2罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的合成

聚乳酸-羟基乙酸共聚物200mg完全溶解于10ml二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入4.6mgn-羟基丁二酰亚胺、120μl三乙胺和7.8mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，逐渐升温至室温反应12小时，得到反应液a，将6.7μl乙二胺加到4ml二氯甲烷溶液、混合均匀，然后将乙二胺的二氯甲烷溶液逐滴加到反应液a中，室温反应23小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，得到中间体b(乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物)；

将10mg罗丹明b和2.8mg1-羟基苯并三唑完全溶解于12ml无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入30μl三乙胺，搅拌均匀后，加入10.7mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应10小时，得到反应液c，将140mg中间体b完全溶解于6ml二氯甲烷中，得到中间体b的二氯甲烷溶液，将此溶液逐步滴加到反应液c中，避光、室温反应23小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水、2mol/l的盐酸溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，其分子结构式如图1所示。

将干燥后的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行傅里叶红外光谱仪、核磁共振仪和差示扫描量热仪检测，进行特征峰分析。

红外光谱图表明，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的图谱中同时具有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特征峰：1750cm^-1(c＝o伸缩振动峰)，1188cm^-1和1094cm^-1(c—o—c伸缩振动峰)；罗丹明b的特征峰：1596cm^-1和1519cm^-1(芳环骨架伸缩振动峰)；以及1674cm^-1和1542cm^-1是酰胺ⅰ谱带和酰胺ⅱ谱带的两个特征吸收峰，表明共聚物分子中酰胺键成功键合。

罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的¹h核磁共振谱图表明，在化学位移值(δ)4.70-5.30ppm和8.00ppm附近具有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质子和罗丹明b芳环质子的特征吸收峰，表明聚乳酸-羟基乙酸共聚物已成功键合罗丹明b。

差示扫描量热仪图谱表明，聚乳酸-羟基乙酸共聚物和罗丹明b的物理混合物中，同时具有198-200℃罗丹明b的特征吸热峰和48-49℃聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特征吸热峰；而罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特征吸热峰在228-229℃，表明罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物成功化学键合。

实施例3罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的荧光稳定性考察

为考察罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物是否能够发射荧光，将实施例2制备得到的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物5mg完全溶解于二氯甲烷中，制得浓度为0.5mg/ml罗丹明b修饰的共聚物的二氯甲烷溶液；取罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液0.4ml，加入甲醇制得浓度为4μg/ml罗丹明b修饰的共聚物的甲醇溶液，荧光分光光度仪检测，光谱图见图2；将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的甲醇溶液，在自然光下分别于37℃和4℃放置一定时间，考察罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的荧光稳定性，具体参见图3。

由图2光谱图可知，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物受到光激发后，具备良好的光发射性能，发射波长峰位位于566nm。由图3罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物在自然光、不同温度下稳定性研究结果可知，制备的荧光生物材料光学稳定性良好。

实施例4罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的合成

聚乳酸-羟基乙酸共聚物200mg完全溶解于10ml二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入4.6mgn-羟基丁二酰亚胺、120μl三乙胺和7.8mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，逐渐升温至室温反应12小时，得到反应液a，将6.7μl乙二胺加到4ml二氯甲烷溶液、混合均匀，然后将乙二胺的二氯甲烷溶液逐滴加到反应液a中，室温反应24小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，得到中间体b(乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物)；

将10mg罗丹明b和2.8mg1-羟基苯并三唑完全溶解于12ml无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入40μl三乙胺，搅拌均匀后，加入10.7mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应10小时，得到反应液c，将140mg中间体b完全溶解于6ml二氯甲烷中，得到中间体b的二氯甲烷溶液，将此溶液逐步滴加到反应液c中，避光、室温反应24小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水、2mol/l的盐酸溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

实施例5罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的合成

聚乳酸-羟基乙酸共聚物250mg完全溶解于12ml二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入5.8mgn-羟基丁二酰亚胺、150μl三乙胺和10mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，逐渐升温至室温反应12小时，得到反应液a，将8.3μl乙二胺加到4.8ml二氯甲烷溶液、混合均匀，然后将乙二胺的二氯甲烷溶液逐滴加到反应液a中，室温反应24小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，得到中间体b(乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物)；

将14mg罗丹明b和3.9mg1-羟基苯并三唑完全溶解于17ml无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入50μl三乙胺，搅拌均匀后，加入15mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应10小时，得到反应液c，将200mg中间体b完全溶解于8.4ml二氯甲烷中，得到中间体b的二氯甲烷溶液，将此溶液逐步滴加到反应液c中，避光、室温反应24小时，反应结束后，对反应体系依次用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水、2mol/l的盐酸溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

实施例6双发射荧光纳米粒的制备

将实施例5制得的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物150mg和香豆素62.5mg完全溶解于8ml二氯甲烷中，将其加入到、置于磁力搅拌器上的32ml浓度为1g/100ml的聚乙烯醇水溶液中，得到混合液d，对混合液d依次进行均质处理1分钟、探针式超声仪处理处理2分钟、室温、避光磁力搅拌5小时，使其完全固化形成纳米粒，再经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到双发射荧光纳米粒。

实施例7双发射荧光纳米粒的荧光信号考察

为考察双发射荧光纳米粒是否能够受到特定波长的光激发后发射绿色和红色荧光信号，将实施例6制备得到的双发射荧光纳米粒分散于缓冲溶液，均匀涂布于载玻片上，置于荧光显微镜检测，具体参见图4。

荧光显微镜下可以清楚地观察到，同一个双发射荧光纳米粒的香豆素6的绿色荧光信号和载体材料罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的红色荧光信号，以及合成图的黄色荧光信号，见图4所示，表明所制备的双发射荧光纳米粒在受到特定波长的光激发后，能够同时发射绿色和红色荧光信号。

实施例8双发射荧光纳米粒的制备

将实施例4制得的罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物120mg和香豆素62mg完全溶解于7ml二氯甲烷中，将其加入到、置于磁力搅拌器上的28ml浓度为1g/100ml的聚乙烯醇水溶液中，得到混合液d，对混合液d依次进行均质处理2分钟、探针式超声仪处理处理2分钟、室温、避光磁力搅拌6小时，使其完全固化形成纳米粒，再经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到双发射荧光纳米粒。

在透射电子显微镜下观察纳米粒的形态，如图5所示，可以看出纳米粒为球形，表面光滑完整。用激光粒度分布仪测试纳米粒的体积平均粒径为0.371μm，粒度分布如图6所示。

实施例9双发射荧光纳米粒的制备方法

(1)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温反应10小时，得到反应液a；将乙二胺的二氯甲烷溶液滴加到反应液a中，室温反应24小时，反应结束后，对反应体系依次进行洗涤、过滤，减压干燥，得到乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，即中间体b；

其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的总量的比为250mg：142mg，n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:20:2；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙二胺的摩尔比为1:9；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液与乙二胺的二氯甲烷溶液的体积比为5:2。

(2)将罗丹明b与1-羟基苯并三唑溶解于无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入三乙胺，搅拌均匀后，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应8小时，得到反应液c，将中间体b的二氯甲烷溶液滴加到反应液c中，避光、室温反应24小时，反应结束后，对反应体系依次进行洗涤、过滤，减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

其中，罗丹明b、1-羟基苯并三唑、三乙胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为3:3:10:8。

中间体b与罗丹明b的摩尔比为1:3，罗丹明b的无水二氯甲烷溶液与中间体b的二氯甲烷溶液的体积比为2:1。

(3)将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6溶解于二氯甲烷中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的二氯甲烷中罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为15mg/ml；按照体积比为1:4将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液加入到浓度为1g/100ml的聚乙烯醇水溶液中，得到混合液d，对混合液d依次进行均质处理1分钟、超声处理2分钟、室温、避光搅拌4小时、离心、洗涤、干燥，得到双发射荧光纳米粒。其中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的摩尔比为1:1。

实施例10双发射荧光纳米粒的制备方法

(1)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷中，冰浴、搅拌状态下，依次加入n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温反应12小时，得到反应液a；将乙二胺的二氯甲烷溶液滴加到反应液a中，室温反应18小时，反应结束后，对反应体系依次进行洗涤、过滤，减压干燥，得到乙二胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，即中间体b；

其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的总量的比为150mg：85mg，n-羟基丁二酰亚胺、三乙胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:25:1.5；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙二胺的摩尔比为1:11；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液与乙二胺的二氯甲烷溶液的体积比为5:2。

(2)将罗丹明b与1-羟基苯并三唑溶解于无水二氯甲烷中，冰浴、避光、搅拌状态下，加入三乙胺，搅拌均匀后，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，避光、室温反应10小时，得到反应液c，将中间体b的二氯甲烷溶液滴加到反应液c中，避光、室温反应18小时，反应结束后，对反应体系依次进行洗涤、过滤，减压干燥，即得到罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

其中，罗丹明b、1-羟基苯并三唑、三乙胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为3:3:30:8。

中间体b与罗丹明b的摩尔比为1:3，罗丹明b的无水二氯甲烷溶液与中间体b的二氯甲烷溶液的体积比为2:1。

(3)将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6溶解于二氯甲烷中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的二氯甲烷中罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为15mg/ml；按照体积比为1:4将罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液加入到浓度为1g/100ml的聚乙烯醇水溶液中，得到混合液d，对混合液d依次进行均质处理2分钟、超声处理3分钟、室温、避光搅拌6小时、离心、洗涤、干燥，得到双发射荧光纳米粒。其中，罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和香豆素6的摩尔比为1:1。

由上述实施例可知，本发明以罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体材料制备的双发射荧光纳米粒，表面光滑完整，粒径分布均匀，受到吸收光激发后可发射绿色和红色荧光信号，且稳定性好，荧光效果显著。

本发明通过中间连接分子乙二胺，将罗丹明b和聚乳酸-羟基乙酸共聚物共价连接，制备得到具有荧光发射功能的生物相容性材料罗丹明b修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，然后以荧光生物相容性材料包载荧光示踪剂，制备得双发射荧光纳米粒。本发明涉及的制备方法原料简单易得、反应条件温和，所制备的双发射荧光纳米粒表面光滑完整，粒径分布均匀，稳定性好，具有良好的双荧光发射性能。所述的双发射荧光纳米粒能够实现可视化的监测，可用于临床诊断及药物评价领域，具有良好的应用前景。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。