本发明涉及植物种属鉴定
技术领域：
，尤其涉及一种用于人参和西洋参鉴定的组合条形码序列及其精准鉴定方法。
背景技术：
：人参(panaxginseng)是五加科植物人参的干燥根和根茎，栽培的人参俗称“园参”；播种在山林野生状态下自然生长的人参称“林下山参”，习称“籽海”。人参作为上品的补益药使用已有两千多年的历史，是中国最常用的、最重要的、最珍贵的传统中药材之一。人参是名贵中药材中，也是应用最广泛、研究最深入的中药之一，具有很高的药用价值，即在医疗以及养生方面具有可观的价值，具有补气、固脱、生津、益智、安神的功效，且补虚效果显著。现代临床常用人参来治疗各种原因引起的休克、心力衰竭、急性脑血管损伤等疾病。最新的研究进展表明，人参含有丰富的三萜皂苷类及多糖类等生物活性成分，这些活性成分尤其是皂苷类成分，其具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗过敏、抗疲劳、抗应激、抗辐射、抗衰老、抗骨质疏松、免疫调节、调血脂、降血糖、保肝、保护中枢神经及心脑血管系统等。西洋参(panaxquinquefolium)，又名花旗参，是五加科植物西洋参的干燥根。西洋参味苦，性凉，入心、肺、肾经，功能以补益为主，补气养阴，清热生津，用于气虚阴亏、内热、咳喘痰血、虚热烦倦等症。西洋参既是一种具有特殊医药价值的名贵中药材，又是高级滋补佳品。西洋参中含有多种有效成分，具有抗肿瘤、抗癌、降血压、降血脂等多方面的药理活性，同时还具有补气养阴、益胃生津、清热解烦等功效。准确的物种鉴定是人类认知及应用生物多样性和可持续发展的必要前提。人参属植物大多是传统中药材，具有调理机体、延年益寿及抗肿瘤、抗衰老等功能，人们对人参属植物的需求量越来越大，而人参属植物如人参和西洋参不管是在形状还是颜色上都非常相似，利用传统的形态学特征进行鉴定的方法已很难将其区分开来，加上人参属植物价格差别大，一些不法分子为了谋取私利，使用人参来冒充西洋参，用掺假品甚至假品来欺骗消费者，不仅损害了消费者的权益，也不利于市场秩序的维护。因此，找到一种稳定可靠的方法将人参和西洋参区分开来，对保障消费者利益、维护市场秩序等都具有十分重要的意义。目前，针对人参和西洋参的分子鉴定都还只是应用单个条形码进行鉴定的现状，而我们知道核糖体和叶绿体dna的各个条形码在药用植物鉴定中各有优缺点，因此，基于核基因组its区序列和叶绿体基因组trnl-trnf区序列的优点，寻找适用于人参和西洋参的条形码或其组合，构建更加完善的公共序列数据库，对实现人参和西洋参药用植物物种的准确鉴定具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有只是应用单个条形码进行人参和西洋参鉴定的方法所存在的局限性进行改进，即提供一种用于人参和西洋参鉴定的组合条形码序列，其组合了核基因组的its区序列和叶绿体基因组的trnl-trnf区序列，同时还提供一种采用组合条形码序列its+trnl-trnf对人参和西洋参进行精准鉴定的方法。本发明一种用于人参和西洋参鉴定的组合条形码序列，该组合条形码序列由its区序列和trnl-trnf区序列构成，为its+trnl-trnf，其核苷酸序列记为seqidno：1。its序列位于核糖体dna的基因转录间隔区，该部分由its1、5.8s基因和its2区序列组成，引物通用性好，ncbi数据库中收录的序列数量多，具有高度的变异性，可以提供丰富的特异位点，且pcr扩增反应时对模板的要求很低，易于操作，在药用植物dna条形码鉴定中具有较大的优势，但its序列具有被真菌污染的风险。叶绿体基因组的trnl-trnf区属于非编码区，片段长度适中，受外界环境选择压力小，且提供的遗传信息较多，目前也较广泛地应用于植物系统学研究。针对以上两点情况，本发明还提供一种鉴定人参和西洋参的方法，其采用组合条形码序列its+trnl-trnf对人参和西洋参进行精准鉴定，该方法一方面提供了更多的变异位点，能够更加准确的鉴别人参和西洋参，另一方面也可避免可能发生的its被真菌污染的风险，最终为人参和西洋参中药材药用植物的物种识别提供分子生物学证据。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：本发明提供一种用于人参和西洋参鉴定的组合条形码序列，该组合条形码序列由its区序列和trnl-trnf区序列拼接构成，为its+trnl-trnf，其核苷酸序列记为seqidno：1。本发明一种鉴定人参和西洋参的方法，采用组合条形码序列its+trnl-trnf进行鉴定，包括如下步骤：步骤1：提取待测样品的dna，待测样品先经过预处理后才进行待测样品的dna提取，所述预处理是取待测样品浸泡于质量百分比浓度为75％的乙醇溶液中，并于5min后放置于无菌环境中风干，然后在液氮冷却的条件下研磨至粉末状，该粉末状物质即为待测样品；将该待测样品采用dna提取试剂盒进行dna的提取，或者采用ctab法提取dna，得到待测样品dna。步骤2：its区序列的上、下游引物分别为引物its4和引物its5，trnl-trnf区序列的上、下游引物分别为引物f、引物r，使用its区序列的引物its4和引物its5，以及使用trnl-trnf区序列的引物f、引物r分别进行pcr扩增反应，得到待测样品its区序列和待测样品trnl-trnf区序列，所述引物its4的核苷酸序列为seqidno：2，所述引物its5的核苷酸序列为seqidno：3；所述引物f的核苷酸序列为如seqidno：4；所述引物r的核苷酸序列为seqidno：5。上述pcr扩增反应的反应体系总体积为20μl，该反应体系包含2.5mmol/lmgcl2的10×pcrbuffer2μl、四种2.5mmol/l单核苷酸1.6μl、10μmol/lits区序列的上游引物或trnl-trnf区序列的上游引物0.8μl、10μmol/lits区序列的上游引物或trnl-trnf区序列的下游引物0.8μl，5u/μlhifidna聚合酶0.1μl和模板dna50ng，余量为无菌超纯水，所述四种2.5mmol/l单核苷酸可以为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶。上述pcr扩增反应的过程依次为：95℃预变性3min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。步骤3：将步骤2得到的待测样品its区序列和待测样品trnl-trnf区序列拼接后，得到组合条形码序列its+trnl-trnf，再导入软件mega进行比对；拼接及导入软件mega前，先将待测样品its区序列和待测样品trnl-trnf区序列分别进行比对，匹配后，切除各自引物端，按照5’-3’的方向进行拼接，得到组合条形码序列its+trnl-trnf，之后导入软件mega进行分析该组合条形码序列：如果自seqidno：1序列中的5’端起第147位碱基为a、第266位碱基为a、第445位碱基为c、第456位碱基为t、第892位碱基为c、第978位碱基为t，则鉴定为人参；如果自seqidno：1序列中的5’端起第147位碱基为c、第266位碱基为g、第445位碱基为t、第456位碱基为c、第892位碱基为g、第978位碱基为c，则鉴定为西洋参。上述步骤3中，从待测样品得到的组合条形码序列its+trnl-trnf必须满足第147位碱基为a、第266位碱基为a、第445位碱基为c、第456位碱基为t、第892位碱基为c、第978位碱基为t这6个条件时，该待测样品才能判定为人参，当全部不满足上述6个条件，或满足小于上述6个条件时，均判定该待测样品不是人参。上述步骤3中，从待测样品得到的组合条形码序列its+trnl-trnf必须满足第147位碱基为c、第266位碱基为g、第445位碱基为t、第456位碱基为c、第892位碱基为g、第978位碱基为c这6个条件时，该待测样品才能判定为西洋参，当全部不满足上述6个条件，或满足小于上述6个条件时，均判定该待测样品不是西洋参。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明一种用于人参和西洋参鉴定的组合条形码序列，具有引物通用性好和高度的变异性，可以提供丰富的特异位点，且pcr扩增反应时对模板的要求很低，易于操作，在药用植物dna条形码鉴定中具有较大的优势，同时兼具受外界环境选择压力小，可提供的遗传信息较多。本发明一种鉴定人参和西洋参的方法，应用组合条形码序列its+trnl-trnf，采用its区序列和trnl-trnf区序列拼接后，得到区分人参和西洋参的6个信息位点，通过比对组合条形码序列its+trnl-trnf及其6个信息位点，可以简单快速且有效地在分子生物学水平上对人参和西洋参进行分子鉴定，具有鉴定准确度高、操作简单、成本低廉等优点，有利于大规模推广使用。【具体实施方式】以下通过具体实施例进行说明。实例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。本实例所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可通过购买获得，且试剂均为分析纯。实施例1：人参属样品its区序列和trnl-trnf区序列的获得1、待测样品的dna提取(1)从不同产地收集多份人参和西洋参样品，如表1所示。表1：人参和西洋参样品采集信息序号样品取样部位采集地1人参叶片辽宁丹东2人参根部辽宁丹东3人参根部辽宁辽阳4人参根部辽宁辽阳5人参根部辽宁抚顺6人参根部辽宁抚顺7西洋参叶片吉林靖宇8西洋参根部吉林吉安9西洋参根部北京怀柔10西洋参根部北京怀柔11西洋参根部山东文登12西洋参根部吉林抚松(2)采用ctab法对表1的待测样品进行dna提取，具体操作如下：1)将待测样品浸泡在75％乙醇中5分钟，之后取出，并放置在无菌环境中自然风干。2)取2g待测样品，加液氮研磨至粉末状，置于10ml离心管中，然后加入65℃预热的3×ctab提取液4.5ml，sds0.5ml混匀后在65℃水浴1h，且每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述的3×ctab提取液配方为：3％ctab，0.1mol/ltris-hcl，1.4mol/lnacl，2％pvpp，25mmol/ledta，高温高压灭菌；其中，2％β-巯基乙醇为灭菌、冷却后加入，上述体系中的百分比均为体积占比。3)水浴结束后，在12000rpm的条件下离心5min，取中层清液分装至1.5ml离心管，加等体积tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀后在12000rpm条件下离心10min，取上层清液至新1.5ml离心管，加等体积氯仿-异戊醇(24:1)，混匀后再在12000rpm的条件下离心10min，取上层清液，加0.6倍体积异丙醇，再加3mol/l醋酸钠，至醋酸钠最终浓度为0.3mol/l，在-20℃条件下沉淀1h，并在12000rpm的条件下离心10min，舍弃上层清液，得到沉淀，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，之后在12000rpm条件下离心5min，再舍弃上层清液，得到沉淀，重复洗涤2-3次。洗涤完毕后风干沉淀，加50μl无菌水或1×te溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到待测样品dna。2、pcr扩增(1)对表1中的样品所得的待测样品dna分别进行its区序列和trnl-trnf区序列扩增反应，its区序列的上下游引物分别为引物its4和引物its5，trnl-trnf区序列的上下游引物分别为引物f和引物r。1)使用引物its4和引物its5对待测样品dna进行its序列进行扩增反应，得到待测样品its序列。引物its4的核苷酸序列为seqidno：2，具体为：5’tcctccgcttattgatatgc3’。引物its5的核苷酸序列为seqidno：3，具体为：5’ggaagtaaaagtcgtaacaagg3’。2)使用引物f和引物r对待测dna样品分别进行trnl-trnf序列进行扩增反应，得到待测样品trnl-trnf序列。引物f的的核苷酸序列为seqidno：4，具体为：f：5’ggttcaagtccctctatccc3’。引物r的的核苷酸序列为seqidno：4，具体为：r：5’atttgaactggtgacacgag3’。上述引物its4、引物its5、引物f和引物r由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(2)pcr反应体系：pcr扩增的反应体系总体积为20μl，该反应体系包含2.5mmol/lmgcl2的10×pcrbuffer2μl、四种2.5mmol/l单核苷酸1.6μl、10μmol/lits区序列的上游引物或trnl-trnf区序列的上游引物0.8μl、10μmol/lits区序列的上游引物或trnl-trnf区序列的下游引物0.8μl，5u/μlhifidna聚合酶0.1μl和模板dna50ng，余量为无菌超纯水。所述四种2.5mmol/l单核苷酸可以为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶。(3)pcr扩增反应过程依次为：95℃预变性3min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。本实施例中pcr扩增采用北京全式金生物技术有限公司hifi试剂盒。3、pcr产物纯化、连接及转化pcr扩增产物采用dna凝胶回收试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkit)进行割胶回收。人参和西洋参rdna-its序列和trnl-trnf序列的pcr扩增产物从1％的琼脂凝胶感受态细胞，之后进行氨苄青霉素选择。4、测序挑取单克隆菌落送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序，测序的引物与上述pcr引物一致。为确保dna条形码序列的可靠性，需要进行正反测序或重复测序，然后将正反测序结果进行拼接获得待测样品dna组合条形码序列its+trnl-trnf。5、序列拼接本实施例采用应用软件seqman对待测样品its序列和待测样品trnl-trnf序列进行序列拼接及校对。6、序列比对用mega7.0软件对测序后的各个待测样品its序列和待测样品trnl-trnf序列进行比对，然后切除各自引物端，按照5’-3’的方向进行拼接，得到its+trnl-trnf的组合序列，如果自seqidno：1所示序列的5’端起，人参的第147位为a、第266位为a、第445位为c、第456位为t、第892位为c、第978位为t；而西洋参的第147位为c、第266位为g、第445位为t、第456位为c、第892位为g、第978位为c。因此，可根据上述六个碱基位点的特异性进行准确区分人参和西洋参。实施例2与实施例1相比，所不同的是将实施例1中的人参和西洋参制备成饮片，以该饮片为样品，提取dna，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的六个碱基位点。实施例3与实施例1相比，所不同的是将实施例1中的人参和西洋参制备成粉末，以该粉末为样品，提取dna，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的六个碱基位点。当前第1页12