专利名称：青霉属真菌m1及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种青霉属真菌及其在发酵领域的新用途，特别涉及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的新用途。属于生物技术领域。
背景技术：
人参系五加科(Araliaceae)人参属植物人参(Panax ginseng C. A. Mey)的干燥根及根茎，具有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生长等多种作用。作为传统的名贵中药，人参中含有的人参皂苷类成分具有多方面显著的药理活性。西洋参为五加科人参属植物西洋参(Panax quinquefoliumL.)的干燥根，原产于北美州的加拿大和美国，后经引种进入我国，具有补气养阴，清热生津·的功效，用于气虚阴亏，内热，咳喘痰血，虚热烦倦，消渴，口燥咽干等症，能够降血糖、降血月旨、强心、健胃及抗衰老等，在保健和治疗上应用广泛，其主要有效成分亦为人参皂苷类成分。目前，人参皂苷主要从人参和西洋参等植物中分离获取，由于人参和西洋参二者自身的生理特性，无论野生还是栽培通常需要四到六年才能收获药用，并且容易受到气候、栽培条件及病虫害的影响，逐渐呈现栽培土地短缺、价格日趋昂贵的态势。应用微生物发酵法提高人参皂苷的产量，与化学法和酶法等相比，反应周期短，成本低，条件容易控制。本研究利用功能真菌对人参与西洋参药材进行发酵培养，并对发酵前后的皂苷含量进行分析比较，能够显著提高两种药材发酵产物中皂苷类成分的含量，可为人参和西洋参药材资源的充分开发和综合利用提供新方法、新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，以及一株能够提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的菌株，为此，本发明采用了以下技术手段本发明利用功能真菌对人参或西洋参药材进行发酵培养，并对发酵前后的皂苷类化合物的含量进行分析比较，最终得到了一株能够显著提高两种药材发酵过程中皂苷类化合物的产量的菌株，经鉴定该菌株为青霉属真菌(Penicillium sp.),命名为青霉属真菌Ml,分类命名为青霉(Penicillium sp.),该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO. 6359，保藏日期为2012年7月13日。将该菌株用于人参或西洋参的发酵生产，结果发现接种了该菌株的发酵产物中皂苷类化合物的产量相较于没有接种菌种之前药材中皂苷类化合物的含量得到了很大提高，因此，本发明提出了青霉属真菌(Penicillium sp.)在提高人参或西洋参发酵过程中阜苷类化合物产量中的应用。
在本发明中，优选的，所述的青霉属真菌为青霉属真菌Ml，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCN0. 6359。在本发明中，所述的人参或西洋参发酵产物是指人参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物；或西洋参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物。进一步的，本发明还提出了一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，其特征在于包括以下步骤称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，加入蒸馏水润湿药材，湿热灭菌，冷却后接入青霉属真菌种子液，20-37°C无菌暗培养3-24天。在本发明中，优选的，所述的一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，是按照以下步骤进行的称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中， 按照每克人参或西洋参药材粉末加入O. 5-1. 5ml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材(即加入的蒸馏水的体积(ml)与人参或西洋参药材粉末的重量(g)比为O. 5-1. 5:1)，121°C湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末(未加蒸馏水润湿之前的固体粉末)加入O. 25-0. 75ml的量接入青霉属真菌种子液，20°C无菌暗培养6_21天；其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28°C暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有IOOmlPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120_130r/min，28°C培养2_5天，备用。更优选的，所述的一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，是按照以下步骤进行的称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入Iml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材(即加入的蒸馏水的体积(ml)与人参或西洋参药材粉末的重量(g)比为1:1)，121 °C湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末加入O. 5ml的量接入青霉属真菌种子液，20°C无菌暗培养12天；其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28°C暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有IOOmlPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120r/min，28°C培养5天，备用。在本发明中，优选的，所述的青霉属真菌为青霉属真菌Ml，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCN0. 6359。在本发明中，优选的，所述的湿热灭菌为121°C湿热灭菌30min。在本发明中，优选的，所述的人参或西洋参药材包括人参的根、根茎、叶以及茎，还包括西洋参的根、根茎、叶以及茎。利用本发明的方法制备得到人参或西洋参的发酵产物，经检测其中所含有的总皂苷以及单体皂苷的产量相较于未接种青霉属真菌种子液的人参或西洋参的药材粉末都有极显著的提高。
图I为青霉属真菌Ml的菌落形态(正面)；图2为青霉属真菌Ml的菌落形态(反面)；图3为显微镜下所观察到的青霉属真菌Ml的菌丝形态图；图4为显微镜下所观察到的青霉属真菌Ml的分生孢子梗及孢子形态图；图5为菌株Ml扩增产物电泳图谱； 图6为青霉属真菌Ml与其他菌株的聚类结果；图7为人参总皂苷紫外吸收光谱扫描图；图8为接种真菌Ml后人参药材发酵产物中六种单体皂苷含量变化趋势图；图9为人参药材接种Ml菌后发酵产物中六种单体皂苷的HPLC色谱图；注a M1菌第O天的发酵产物；b M1菌第18天的发酵产物；1飞依次为人参皂苷 Rgl、Re、Rbl、Re、Rb2 和 Rd ；图10为接种真菌Ml后人参药材发酵产物单体皂苷含量测定结果；图11为西洋参药材的Ml菌发酵产物中人参总皂苷含量变化趋势图；图12为西洋参药材的Ml菌发酵产物中皂苷含量HPLC测定色谱图；注a_人参皂苷标准品；b_Ml菌液；c_j依次为M1菌第0、3、6、9、12、15、18、21天的发酵产物；1 6依次为人参皂苷Rgl、Re、Rbl、Rc、Rb2和Rd ;7_8号峰只存在于Ml菌发酵产物中的新物质；9号峰只存在于西洋参药材和Ml菌初期发酵产物中的物质；图13为接种真菌Ml后西洋参药材发酵产物中单体皂苷含量变化趋势图；图14为西洋参叶的Ml菌发酵产物中总皂苷含量变化趋势图；图15为西洋参茎的Ml菌发酵产物中总皂苷含量变化趋势图。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例I真菌Ml的分离纯化I实验仪器及材料I. I 材料人参药材购自哈药集团世一堂制药有限公司，经黑龙江中医药大学生药学教研室都晓伟教授鉴定为五加科植物人参(Panax ginseng C. A. Mey)的干燥根及根莖。I. 2 仪器AB204-N型电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司);手提式压力蒸汽消毒器(无锡市长江医疗器械有限公司)；100级洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；SPX-150C型恒温恒湿箱(上海博迅实业有限公司设备厂)。I. 3用具及试剂用具剪刀，镊子，纱布，滤纸，脱脂棉，培养皿，试管等。试剂鹿糖,分析纯,天津市化学试剂一厂；葡萄糖，分析纯，天津市化学试剂一厂；琼脂，分析纯，日本产；乙醇，分析纯，北京益利精细化学品有限公司；轻质液状石蜡，药用，吉林市吉化江城油脂化工有限责任公司。I. 4马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)的制备马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水IOOOmL,将马铃薯去皮，切成约2cm3的小块，放入1500mL的烧杯中，加入IOOOmL蒸馏水煮沸30min，注意用玻璃棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加水补足至1000mL。分装后加葡萄糖和琼脂，121°C湿热灭菌30min。 2实验方法2. I真菌的分离将人参药材在28°C、80%湿度条件下进行发酵培养，取不同时期培养物，随机挑取少量菌丝接种于PDA平板培养基上，每个培养皿内接种3点，同时做3个平行样。接种好的培养皿置于28°C恒温培养箱中暗培养5天，每天观察记录。另取3个不接种菌丝的空白培养皿，置于28°C恒温培养箱中暗培养7天，每天观察记录，作为空白对照组。2. 2真菌的纯化待接种点处长出新菌丝后，根据长出菌落的形态、大小、颜色的不同，挑取菌落边缘的菌丝，接于新的平板上进行培养，继续观察。采用三点法逐步纯化，培养数日后，观察菌落的形态及颜色是否均匀，边缘是否整齐，确定是否纯化。2. 3真菌菌种保存将多次纯化的菌种，移至试管PDA斜面培养基上，28°C下暗培养5天，待观察没有污染后，加入无菌液体石蜡，液面高于培养基上缘Icm左右，对菌株编号后，放于4°C的冰箱中保存。3实验结果与分析从人参培养物中分离出的真菌，经初步纯化后，菌落表面形态颜色均一，边缘整齐。对照组无杂菌长出，其菌图见图I。实施例2活性真菌的菌种鉴定一、活性真菌的形态学鉴定I实验材料I. I实验材料人参中分离得到的真菌Ml。I. 2仪器试剂Motic BA-400数码显微图像系统，麦克奥迪公司；乳酸，化学纯，天津市凯通化学试剂有限公司；苯酚，化学纯，吉林吉化公司；甘油，化学纯，吉林吉化公司；水溶苯胺兰，上海标本模型厂。2实验方法2. I菌株的形态学鉴定2. I. I标本片的制备2. I. I. I 载片培养取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一 U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。，在滤纸上滴加灭菌后的20%甘油液3 4ml，以防止培养过程中培养基干燥，然后盖上平皿盖，放在28°C的培养箱内培养，定期取出在显微镜下观察，记录孢子萌发、菌丝的生长、孢子囊柄与孢子囊孢形成的过程、孢子着生状态等。2. I. 3. 2 挑片观察在载玻片上加一滴乳酸苯酚液棉兰染色液，用接种针从生长有真菌的平板中挑取带有孢子的真菌菌丝，放入载玻片上的液滴中，并且用针尖将其分散开，盖好盖玻片即得载片标本。(乳酸苯酹液制备苯酹IOg,乳酸IOg,甘油20g,蒸懼水IOml,将水与苯酹混合直到溶解，然后加入乳酸和甘油)。2. I. 3. 3 插片培养插片法将真菌接种在琼脂平板上，将灭菌的盖玻片45度角插于固体培养基中，使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。3实验结果与分析3. I菌株Ml形态特征菌落形态菌株Ml接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28°C，暗培养4天，观察到整个菌落致密扁平，直径2. 6cm,正面呈灰绿色短毛状，菌丝平伏，边缘整齐，表面具有·放射状皱纹，背面暗黄色，见图1，图2。个体形态显微镜下显示，菌丝纤细分枝，有隔，无色透明；菌丝发生直立的分生孢子梗；梗的顶端具有指状分枝，每枝顶端生有一串孢子，形成扫帚状见图3，图4。二、功能真菌的分子生物学鉴定I实验材料实验材料人参发酵物中分离得到的真菌Ml。实验仪器Motic BA-400数码显微图像系统，麦克奥迪公司；XS105 Dual Range型电子分析天平，瑞士 METTLER TOLEDO公司；Allegra 64R型高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；NN-GT347H型微波炉，Panasonic公司；DYY11B型三恒电泳仪、DYCP-31A型电泳槽,北京市六一仪器厂；ThermalCycler PCR扩增仪，德国印pendorf公司；WFH_201BT型可见反射透射仪，上海精科实业有限公司；微量移液枪，dragon-med。实验试剂引物W0508077ITS1 (序列5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)，W0508078ITS4 (序列5’ -TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’)，(三博远志)6 X DNA loadingbuffer、TE 缓冲液、Marker TIANGENTaq酶、dNTP、10 XBuffer、MgCl2，上海生工生物工程技术服务有限公司琼脂糖、EB (溴化乙锭)，北京鼎国生物技术有限公司。Tris-饱和酚，生物级，哈尔滨市德美生物技术有限公司2实验方法
2. I菌株基因组DNA的提取(I)取活性真菌斜面培养的菌种，接种于PDA液体培养基，28°C，130r/min振荡培养3天。2层纱布过滤出菌丝，用无菌水洗2次，再用灭菌生理盐水洗2次，无菌滤纸吸去菌体表面水分，获得菌丝体； (2)将收集的菌丝加液氮研磨，置于含有700μ I DNA提取缓冲液[200mMTris-HCl(PH=8. O),25mM EDTA(PH=8. 0),250mM NaCl，0. 5%SDS (PH=7. 5)]的 I. 5ml离心管中，用微量移液枪混匀，37°C水浴30min ；(3) 12000r/min离心5min，将上清液移入新的离心管中；(4)加入等体积酹-氯仿(1:1),混勻5min, 12000r/min离心5min,将上清液移入新的离心管；(5)加入等体积氯仿，混匀，12000r/min离心2min，将上层溶液移入新的离心管中；(6)加入2倍体积冰乙醇，-20 V放置2小时；(7)取放置后的DNA提取液，12000r/min离心5min，去上清液，加入70%乙醇，清洗沉淀2次，12000r/min离心2min ；(8)去上清液，挥干溶剂，加入75μ I I XTE溶解沉淀即为DNA模板。(9) DNA模板置于_20°C保存备用。2.2PCR扩增反应在超净工作台内配制PCR扩增试剂，扩增的反应体系如下
体积(μι)
Taq 酶(0_5υ/μ1) 0.5 IOxPCR缓冲液5
引物 1(10μΜ)2
引物 2 ( ΙΟμΜ)2
dNTP ( 2.5mM )0.4
模板DNA3
MgC123
去离子水34.1PCR反应程序如下I、起始变性 94°C 5min,2、变性 94°C30s，3、退火 55°C30s，4、延伸 72°C lmin,5、延伸 72°C lOmin。2-4步骤进行30个循环PCR扩增后，取扩增产物5 μ L，用I. 5%琼脂糖凝胶，I X TAE缓冲液(pH7.6，4mol/L Tris-HCl，2. 5ml 加 O. 05mol/L EDTA5ml，调 ρΗ8· O,定容至 250ml)，在 120V/cm 下电泳，约45min后,在紫外分析仪上检测条带。2. 3PCR扩增产物的序列测定与数据处理PCR扩增产物由上海英骏生物技术有限公司北京测序部纯化测序。将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析,从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用CLUSTAL XI. 83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树。3实验结果与分析3. IPCR扩增产物的电泳检测采用PCR技术对Ml真菌进行DNA中特异ITS序列扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后大约在700bp处可以看到清晰的条带，表明目的序列得到扩增，菌株Ml扩增产物电泳图谱如图5所示。3.2rDNA 序列测定电泳结果显示，提取的植物样本rDNA只有一个条带，纯度很高，经过纯化的基因组DNA的纯度也完全可以满足下一步的PCR扩增。对菌株的基因组DNA的PCR纯化产物进行测序，序列如SEQ ID NO. I所示。3. 3序列分析登陆hppt://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/ 网站，将测序结果与 GeneBank 中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息见表I。表I本发明所使用的ITS序列的GeneBank登录号
权利要求
1.青霉属真菌(Penicilliumsp.)在提高人参或西洋参发酵过程中阜苷类化合物产量中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述的青霉属真菌为青霉属真菌M1，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCCNO. 6359。
3.如权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述的人参或西洋参发酵产物是指人参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物；或西洋参的根发酵产物、根茎发酵产物、叶发酵产物或茎发酵产物。
4.一株青霉属真菌，命名为青霉属真菌Ml，所述菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 6359。
5.一种提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量的方法，其特征在于包括以下步骤 称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，加入蒸馏水润湿药材，湿热灭菌，冷却后接入青霉属真菌种子液，20-37°C无菌暗培养3-24天。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入O. 5-1. 5ml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材，121°C湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末加入O. 25-0. 75ml的量接入青霉属真菌种子液，20°C无菌暗培养6-21天； 其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到 无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28°C暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120-130r/min，28°C培养2_5天，备用。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于称取一定量的人参或西洋参药材粉末，置于锥形瓶中，按照每克人参或西洋参药材粉末加入Iml蒸馏水的量加入蒸馏水润湿药材，121°C湿热灭菌30分钟，冷却后按照每克人参或西洋参药材粉末加入O. 5ml的量接入青霉属真菌种子液，20°C无菌暗培养12天； 其中，所述的青霉属真菌种子液是按照以下方法制备得到 无菌条件下将保存的青霉属真菌菌种从试管中接入PDA平板培养基，28°C暗培养4天，用直径6mm的无菌打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100ml PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱120r/min，28°C培养5天，备用。
8.如权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于所述的青霉属真菌为青霉属真菌M1，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC NO. 6359。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的湿热灭菌为121°C湿热灭菌30min。
10.如权利要求5-7任一项所述的方法,其特征在于所述的人参或西洋参药材包括人参的根、根茎、叶以及莖，还包括西洋参的根、根茎、叶以及茎。
全文摘要
本发明公开了一株青霉属真菌M1及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用，属于生物技术领域。本发明利用功能真菌对人参或西洋参药材进行发酵培养，并对发酵前后的皂苷类化合物的含量进行分析比较，最终得到了一株能够显著提高两种药材发酵过程中皂苷类化合物产量的菌株，经鉴定该菌株为青霉属真菌(Penicillium sp.)，命名为青霉属真菌M1，该菌株保藏编号为CGMCC NO.6359。将该菌株用于人参或西洋参的发酵生产，结果发现接种该菌株的发酵产物中皂苷类化合物的含量得到很大提高，因此，本发明的提出使得青霉属真菌在提高人参或西洋参发酵过程中人参皂苷类化合物产量方面将有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/80GK102943103SQ20121037107
公开日2013年2月27日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者都晓伟, 陈照宇 申请人:都晓伟