双峰驼酪氨酶、编码基因及其获取方法

专利名称：双峰驼酪氨酶、编码基因及其获取方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种在双峰驼酪氨酸酶、编码基因及其获取方法。
背景技术：
酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一种75kD含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。Spritz等证实人TYR是一种铜结合蛋白，有铜A和铜B位点。离子铜特异性能与人TYR结合，一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合。酪氨酸酶在黑色素生物合成过程中，起着重要的催化作用，是迄今已知唯一参与黑色素生物合成的酶。研究发现，酪氨酸酶是一种具有多种生物学功能的蛋白质。主要存在于黑素细胞 中的黑素体内，绝大部分与黑素体膜相结合，只有极少数以游离的状态存在。TYR的多肽链的适当折叠对铜结合及其催化活性是关键性的，TYR突变可中断铜结合使其催化活性丧失。酪氨酸酶是一种独特的具有双重催化功能的酶。在黑色素生物合成过程中，它首先将酪氨酸羟化产生L-多巴(邻位二羟基苯丙氨酸)；然后再将L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌经一系列复杂反应，最后形成黑色素。酪氨酸酶的研究，在1991年，Chen，Js.用实验证实曲酸主要通过干扰酪氨酸酶反应时所需要的氧来抑制黑色素的生成。2007年，王建新等人进行了酪氨酸酶抑制剂和激活剂的研究，表明酪氨酸酶是产生黑色素的主要限速酶，通过激活或抑制酪氨酸酶的活性可促进毛发和皮肤黑素的生成或抑制，达到乌发或皮肤增白的目的。2009年，何学民等人对黑色素与酪氨酸酶进行了研究，结果表明在体内黑色素生成过程中酪氨酸酶起了重要的催化作用，抑制酪氨酸酶活性便能达到减少色素生成的目的。在双峰驼中，酪氨酸酶是骆驼黑素细胞中重要的蛋白，具有催化活性，又是多种物质及生物的受体，与生物医学有着密切的关系。因此，对骆驼酪氨酸酶的研究将有助于细胞生物学和医学的发展。

发明内容
本发明提供了一种双峰驼酪氨酸酶双峰驼酪氨酸酶，该酶与体内黑素细胞密切相关，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。本发明还提供了一种双峰驼酪氨酸酶编码基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. I 所示序列；
(b)由碱基简并或/和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且与(a)编码相同功能蛋白质的序列。本发明还提供了一种双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，该方法包括步骤(I)组织分离(Isolation) ； (2)总RNA的分离(Total RNA isolation):包括①提取RNA的准备工作组织总RNA提取组织总RNA的鉴定。(3)全长cDNA的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括①引物设计及合成RT-PCR扩增；③克隆和测序，其中PCR引物的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4， 其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3’，SEQ ID NO. 4 :Oligo dT。上述总RNA的分离是将双峰驼耳部组织液放入装有Trizol的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30°C温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30°C温育2_3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，后15-30°C温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75%乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。上述克隆和测序包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒。上述质粒的转化为将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴30分钟，然后在42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37°C复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37°C恒温培养10-15小时。上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker 一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam H I和Hin d III。本发明在提供了双峰驼酪氨酸酶基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上，将人、鼠、牛等不同物种酪氨酸酶基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的10个物种的十个酪氨酸酶基因的CDS序列构建了系统发生树。本发明中的双峰驼酪氨酸酶基因的cDNA序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的酪氨酸酶基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列见SEQ ID NO. I。将双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列中的编码序列(⑶S)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO. I中，RT-PCR产物长度为1806bp，电泳结果见图1，其中31-33位为起始密码子ATG，1621-1623位为终止密码子TAA，31-1623位为编码蛋白质区域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1，双峰驼酪氨酸酶基因编码530个氨基酸。双峰驼与牛(AAL02331. 2)、绵羊(NP_001123499. I)的酪氨酸酶核酸序列具有89%的相似性。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的酪氨酸酶基因编码氨基酸序列同源性比较结果见图2。对包括SEQ ID NO. I在内的10个物种的十条酪氨酸酶基因的⑶S序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼酪氨酸酶同牛和绵羊的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼酪氨酸酶基因。本发明所得到的酪氨酸酶蛋白的基因序列和该蛋白结构的数据可用于研究其在黑素合成的下游途径中的重要作用，为阐明双峰驼毛色生成机理和未来产生人为控制的商用价值的毛色提供理论基础和依据，并能够为其它哺乳动物的皮肤与毛发色素形成机理研究奠定一定的生物学基础。


图I为双峰驼酪氨酸酶基因RT-PCR产物电泳图；
图2为构建系统发生树所用酪氨酸酶氨基酸同源性比较；图3为不同物种酪氨酸酶氨基酸序列系统进化树。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例I :双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列的克隆I.组织分离(Isolation)从内蒙古阿拉善盟双峰驼，快速采得样品，将耳部组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。2.总 RNA 的分离(Total RNA isolation)(I)提取RNA的准备工作玻璃制品用0. IM的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. I %的DEPC水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理。Tip头、EP管用0. I %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0. ImlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。(2)组织总RNA提取取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent,invitrogenBRL, USA)的勻衆器管中勻衆。4 °C 12000rpm离心10分钟。吸取上清液，15-30°C温育5分钟。加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15_30°C温育2_3分钟。4°C 12000rpm离心15分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15_30°C温育10分钟，4°C 12000rpm离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加lml75%乙醇洗涤RNA，4°C 7500rpm离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分装，-70°C保存。(3)组织总RNA的鉴定
通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4_5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I X TBE待用。琼脂糖凝胶用IXTBE配制。在IOul上样缓冲液(2 X TBE, 13%菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2-3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。3.全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)(I)引物设计及合成根据GenBanK发表的人(AAA52625. I)、鼠(EDK97062. I)等物种的酪氨酸酶基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼酪氨酸酶cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列。引物用PrimerPremier5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO :3(正向)和SEQ IDN0:4(反向)，序列信息如下 SEQ ID NO :3 :5，-ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3，SEQ ID N0:4(反向)01igo dT(2) RT-PCR 扩增按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver. I. I)要求进行反转录。反转录反应液组成10ul2XBca 1st Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTPMixture,0. 5ulRnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul), Iul OligodT Primer,IulRNA Sample, I. 5ul Rnase Free dH20,总体系为 20ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10分钟，4 °C保存。(3)克隆和测序PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入I. 5mlEP管中。按每IOOmg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOrpm离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOrpm离心15秒，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOrpm离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，IOOOOrpm离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应pMD 18-T Vector (50ng/ul)0. 5ul, DNA20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。质粒的转化。从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取IOOul铺于LB平板上，平板含0. I % (V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒温培养10-15小时。转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板，即引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液及水加上刚才的单菌落就成了 PCR反应体系))的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入O. I % (V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。 质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入I. 5mlEP管中，4000rpm离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟，EP管中液体即为回收的质粒。质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定，研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hind III，保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul,Hin d IIIlul, IOXK Buffer 2ul，DNA彡lul，加dH20至20ul。30°C反应3小时。琼脂糖凝胶电泳检测。重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。实施例2 :双峰驼酪氨酸酶基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
I、双峰驼酪氨酸酶基因编码序列同源性比较在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等九种动物的酪氨酸酶基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO. I序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较(见附图2)。比较结果显示SEQ ID NO. 2序列与牛和绵羊的酪氨酸酶氨基酸序列同源性为89. 00%。2、酪氨酸酶基因编码序列系统发生树构建在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等9种物种的九条酪氨酸酶基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树(见图3)。结果显示双峰驼酪氨酸酶基因同牛和绵羊的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼酪氨酸酶基因。序列表序列表<110>内蒙古农业大学〈120〉双峰驼酪氨酸酶的蛋白编码序列<160>4<170>PatentIn version3. 3<210>1〈211>1806
<212>DNA〈213〉阿拉善盟双峰驼〈400〉Icaaacagaccttgtgagaac tagaggaaga atgctcctgg ctgctttgta ctgcctgctg60tggagtttccagacctccgc tggccatttc cctcgagcct gtgcctcctc caagaacctg120atggagaaggaatgctgccc gccgtgggag ggtgacggga gtccctgtgg ccagctctca180ggcaggggttcctgtcagga catcaatctg tccaaggcac cacctggacc tcagttcccc240ttcacaggggtggatgaccg ggaatcttgg ccctctgtct tttataacag gacctgccag 300tgctttgacaacttcatggg attcaactgt ggaaattgca agtttggctt ccggggaccc360aactgcagagagaggcgact tttggtgaga agaaacatct ttgatttgag tgtcccagag420aagaacaaatttcttgccta cctcacttta gccaaacata ctaccagccc agactacgtc480atccccacgggcacctatgg ccaaatgaat aatggatcaa cacccatgtt caatgacatc540aacgtttatgacctctttgt atggatgcat tattatgtgt caagggacac gctgcttggg600gggtctgaaatctggaaaga cattgatttt gctcatgaag caccaggctt cctgccttgg660catagactcttcttgttgct gtgggaacaa gaaatccaga agctgacagg ggatgagaac720ttcactattccatactggga ctggcgagat gcagacaact gtgaaatttg tacagatgag780tacatgggagggcgcgaccc agtaaaccct aatctactca gcccagcatc cttcttctcc840tcttggcagatcatctgcag ccggctggag gagtacaacc gccggcaggt tctgtgcgac900ggcacgtccgaggggccctt actgcgcaat cccgggaacc acgacccagc gcggaccccg960cggctcccctcctcggctga cgtggagttc tgcctgagtc tgacccagta tgattcgggc1020gccatggataaagccgccaa tttcagcttt agaaacaccc tggaaggatt tgctagtcca1080cttactgggatagcagatgc ctctcaaagc agcatgcaca atgccttgca catcttcatg1140aatggaacaatgtcccaggt gcagggatct gccaacgatc ccattttcct tcttcatcat1200gcatttgttgacagtatttt tgaacagtgg cttcgaaggc accatcctct tcaagaagtc1260taccctgaagccaatgcacc cattgggcac aaccgcgaat cctacatggt tccttttata1320cctctctacagaaatggtga tttctttatt tcatccagag atctgggcta tgactatagc1380tacctacaagattcagaccc ggactttttt caagattaca ttaagccgta cttagaacaa1440gcaagccagatctggccgtg gctcgtcggg gcagccctgg tggggtctgt cctcacggct1500gtgctgggcggactcactcg ccgtttatgt cgtcgaaaga gaaagcagct tcctgaagaa1560aaggagccacttctcatgga aaaggaggat taccacagcc tgctgtacca gagccattta1620taacaggctttggccataga ggaggacctg acctcactct agcttaatgg tgttcaagtc1680cccagaaggtgtcccagcag aaacacagca gatgatcagc actgtaatga aaggcaaagc1740ggactcctccttcaactcag gtagacccca cctgtgcttg ctttgtttgt attctgatca1800tccctt1806<210>2<211>530<212>PRT〈213〉阿拉善盟双峰驼<400>2Oz 102876639 A 0. S !/!矧
212U MLLMLYCLL WSFQTSAGHF PRACASSKNL MEKECCPPWE GDGSPCGQLS GRGSCQDINL 60〔0113〕 SKAPPGPQFP FTGVDDRESW PSVFYNRTCQ CFDNFMGFNC GNCKFGFRGP NCRERRLLVR 120〔0114〕 RNIFDLSVPE KMFLAYLTL AKHTTSPDYV IPTGTYGQMN NGSTPMFNDI NVYDLFVWMH 180I--10115U YYVSRDTLLG GSEIWKDIDF AHEAPGFLPW HRLFLLLWEQ EIQKLTGDEN FTIPYWDWRD 240〔0112 ADNCEICTDE YMGGRDPVNP NLLSPASFFS SWQIICSRLE EYNRRQVLCD GTSEGPLLRN 300〔0117〕 p§p>^p RLPSSADVEF CLSLTQYDSG AMDKMNFSF RNTLEGFASP LTGIADASQS 360〔oils SiALHIFM NGTMSQVQGS ANDPIFLLHH AFVDSIFEQW LRRHHPLQEV YPEANAPIGH §I--10119U PLYRNGDFFI SSRDLGYDYS YLQDSDPDFF QDYIKPYLEQ ASQIWPWLVG 办 80〔012s MLVGSVLTA VLSLTRRLC RRKRKQLPEE SPLLMESD YHSLLYQSHL 530〔0121〕 <210>3〔0122U <211>21〔0123U <212>DNA〔0124〕 <213〉AH〔0125U <400>3
〔0122 ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC 21〔0127U <210>4
〔012s <211〉
〔0129U <212>DNA〔0130〕 <213〉AH
H·1
O
权利要求
1.一种双峰驼酪氨酸酶，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. 2 所示序列； (b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
2.一种双峰驼酪氨酸酶编码基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. I 所示序列； (b)由碱基简并或/和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且与(a)编码相同功能蛋白质的序列。
3.—种双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，该方法包括如下步骤 (1)从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA； (2)根据人、鼠及牛不同物种的酪氨酸酶基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR，其中 引物的正向引物为 SEQ ID NO. 3 :5，-ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3，， 反向引物为 SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ； (3)克隆和测序。
4.按照权利要求3所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于从双峰驼耳部组织液中分离提取总RNA为将双峰驼耳部组织液放入装有Trizol的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30°C温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30°C温育2-3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，后15-30°C温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75%乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。
5.按照权利要求3所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。
6.按照权利要求3所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。
7.按照权利要求3所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述克隆和测序包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。
8.按照权利要求7所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。
9.按照权利要求7所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒。
10.按照权利要求7所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的转化为将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴30分钟，然后在42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37°C复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37°C恒温培养10-15小时。
11.按照权利要求7所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
12.按照权利要求7所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。
13.按照权利要求7所述的双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam H I和Hin d III。
全文摘要
本发明涉及一种在双峰驼酪氨酸酶基因、编码蛋白及其双峰驼酪氨酸酶基因获取方法，本发明通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的酪氨酸酶基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。本发明对包括SEQ ID NO.1在内的10个物种的十条酪氨酸酶基因的CDS序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼酪氨酸酶同牛和绵羊的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼酪氨酸酶基因。
文档编号C12N9/02GK102876639SQ201210370079
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者张文彬, 吉日木图 申请人:张文彬