专利名称：一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型高分辨多色荧光检验技术，尤其是建立一种定量多基因荧光原位杂交分析的方法。本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。
背景技术：
突光原位杂交(FluorescenceIn Situ Hybridization,简称 FISH)技术是近几年发展起来的一种分子细胞遗传学技术，其基本原理是利用碱基的互补性，以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光显微镜收集荧光信号从而对待测核酸进行定性、定量及定位的方法。常用的荧光原位杂交法探针有染色体单一序列探针，染色体重复序列探针，染色体涂染探针。常用方法有单标记荧光原位杂交法，双标记荧光原位杂交法，光谱核型分析(Spectral Karyotyping, SKY),种间杂交彩色分带突光原位杂交技术(Cross-speciescolor banding-FISH，简称Rx-FISH)等。各种荧光原位杂交法探针及方法在研究肿瘤细胞基因组的不稳定性，尤其是染色体不稳定性及数值异常(非整倍体)和结构重排等生物学特性，以及对血液系统恶性肿瘤的诊断，治疗反应监测，预后评估和微小残留病检测中起重要作用。目前市场上常用的单色或双色荧光原位杂交检测方法有其高度的敏感性和特异性，但是一次实验只能用1-2种探针来检测1-2种基因的异常，不能同时观察细胞内多个相关基因的变化情况。本发明克服现有技术的不足，建立了一种高分辨定量多色荧光原位杂交法，采用荧光素标记特异的基因探针，能够高分辨地检测同一标本甚至同一克隆的细胞中多达5-20种基因的异常变化。这些基因异变包括基因易`位，基因缺失和基因扩增等等。
发明内容
本发明建立了一种定量多基因荧光原位杂交方法，采用多色荧光素标记不同的基因，可以在同一时间内定量单个细胞核中多达5-20个基因，使该法更适用于大规模的临床研究。本发明采用的技术方案是:一种定量多基因荧光原位杂交方法，包括如下步骤:I)、探针制作:在常用的数据库如 NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser 和 UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索含检测目的基因的 BAC (Bacterialartificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
2)杂交:将要检测的标本处理好后，加入步骤I)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，变性后杂交过夜；3)洗片，荧光显微镜检:标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA, SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；4)图像采集与分析:米用Zeiss公司多色突光显微镜Axio Imager Z2型,六种滤光片米用Chroma公司分别为:DAPI (SP-100)，Spectrum Green (MFlOl)，Cy3 vl (SP-102)，Texas Red(SP_107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415 (45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD (Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象 处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；5)检测基因个数η为1≤η≤5时，采用上述步骤1)_4)即可完成检测分析，当检测基因个数η为5 < η < 10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10 < n ≤ 15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15 < η < 20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数η为5 < η < 10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下:第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交的新探针准备同步骤I)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2XSSC中洗涤，每张切片滴力口 150 μ I的70%甲酰胺，70°C变性3分钟，迅速置于-20°C预冷的70 %乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10 μ I新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)标本重杂交后图像采集:切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVisionRel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，SpectrumGreen , Cy3 vl, Texas Red, Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因分析。优选地，上述定量多基因荧光原位杂交方法适用于对同一细胞进行5-20种基因分析。具体地，该一种定量多基因荧光原位杂交方法，包括如下步骤:I)、探针制作:在常用的数据库如 NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser 和 UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索含检测目的基因的 BAC (Bacterialartificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇将连接好的DNA在_20°C进行沉淀过夜，次日离心14000rpm，4°C，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70 %乙醇(4°C )，混匀，离心14000rpm，4°C，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；2)杂交:将要检测的标本处理好后，加入步骤I)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，85-90°C变性5分钟，47°C杂交过夜；3)洗片，荧光显微镜检:标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA, SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；4)图像采集与分析:米用Zeiss公司多色突光显微镜Axio Imager Z2型,六种滤光片米用Chroma公司分别为:DAPI (SP-100)，Spectrum Green (MFlOl)，Cy3 vl (SP-102)，Texas Red(SP_107)和Zeiss公司Cy5 (50)，PF-415 (45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD (Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；5)检测基因个数η为I彡η彡5时，采用上述步骤1)_4)即可完成检测分析，当检测基因个数η为5 < η < 10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10 < n ^ 15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15 < η < 20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数η为5 < η < 10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下:第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交新探针准备同步骤I)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2XSSC中洗涤，每张切片滴加150 μ I的70%甲酰胺，70°C变性3分钟，迅速置于_20°C预冷的70%乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10 μ I新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)，标本重杂交后图像采集:切片置于 多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4. 8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum Green , Cy3 vl, Texas Red, Cy5, PF-415六个滤光片通路中的突光信息进行米集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因(5-20种基因)分析。6)结果判断:特异的荧光信号应位于细胞核内，通过信号的数目和位置来判断所检测基因的正常或异变。例如，在正常的双倍体细胞中每个基因一般呈现2个清晰的荧光点；如基因缺失，则荧光信号亦呈现缺失；如基因拷贝数增多，则荧光信号点增多；根据荧光信号的颜色来判断基因的种类。如两种基因发生重组，则会发生两种荧光信号的重叠，产生新的颜色。本发明还提供了上述定量多基因荧光原位杂交方法在检测基因异变中的应用。本发明的有益效果是:相较于传统的荧光原位杂交法技术，定量多色荧光原位杂交法技术的信噪比提高了 5-10倍，这正是同时定量分析单个细胞核内多个基因的前提条件；能在具有不同形态和免疫组化特征的肿瘤区域准确地识别单个细胞的遗传学异常，检测肿瘤细胞群体中的克隆变异；可以在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因，使标本检测效率明显提高，可用于大规模研究临床标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡)；该定量多色荧光原位杂交法技术是寻找和确认临床标本特异性等位基因失衡极其有效的工具。总之，本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。
图1为分别用黄色，红色和蓝色荧光素标记含有Cmyc基因的3个BAC克隆(表2所示)，将这三种探针混合后和正常成纤维双倍体细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示黄，红和蓝色探针和同一基因位点结合，细胞核中最后呈现两个荧光素信号点，每个点由黄，红和蓝三种荧光素重叠而成。表明这三种含Cmyc基因的BAC克隆既可单独也可联合用作检测C-myc基因的FISH探针。图2是本发明将成功制作的Green-C-myc (绿色突光素标记的Ciyc探针)，PF555-P16 (黄色荧光素标记的P16探针)，PF590-RB1 (红色荧光素标记的RBl探针)，HyPer5-CycD (紫色荧光素标记的CycD探针)，PF415-P53 (蓝色荧光素标记的P53探针)5钟探针(表3所示)混合后和人二倍体成纤维细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示在同一细胞核中，每种探针得到两个清晰的荧光信号，5种探针一共获得10个相应的荧光信号点。获得的图像清晰，信噪比高。图3是本发明成功制备的20个基因探针(表4所示)对人二倍体成纤维细胞进行检测获得的图像。首先用五色Green-C-myc (绿色)，PF555-RB1 (黄色)，PF590_MDM2 (红色)，HyPer5-CCNDl (紫色)，PF415-P53 (蓝色)探针组合对人二倍体成纤维细胞进行杂交，第一次杂交实验后照相，DAPI图像下选择视野，定位，记录下图像采集位置，拍照记录。随后对切片进行荧光探针的洗脱，洗脱后再用另外一组五色探针进行重杂交，第二次及以后每次重杂交后，切片置于显微镜下观察并采集图像。DAPI图像下，采用“计算机自动荧光视野重定位法”使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对五种荧光信号进行采集。如此总共洗脱3次，可对同一细胞进行20个基因的分析。
具体实施例方式下面结合具体实 施例对本发明作进一步详细说明，但不限定本发明的保护范围。实施例1:C-myc基因探针的制备一、探针DNA的获取I)划线接种:将3个分别携带有C-myc基因的BAC菌种分别按照如下步骤操作，首先将BAC菌种划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上，37°C培养过夜(约14小时)。2)初始培养:次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放入37°C摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6_8小时。3)过夜培养:每Iml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放置于37°C摇床，转速200rpm，培养过夜(约14-16小时)。4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。二、探针标记1.酶切 DNA:I)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
权利要求
1.一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)、探针制作:在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser 和UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索含检测目的基因的 BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针； 2)杂交:将要检测的标本处理好后，加入步骤I)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，变性后杂交过夜； 3)洗片，荧光显微镜检:标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA, SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果； 4)图像采集与分析: 采用Zeiss公司多色突光显微镜Axio Imager Z2型,六种滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI (SP-100), Spectrum Green (MFlOl), Cy3 vl (SP-102), Texas Red(SP_107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF_415(45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD (Charge-Coupled Device,电荷稱合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像； 5)检测基因个数η为I< η < 5时，采用上述步骤1)_4)即可完成检测分析，当检测基因个数η为5 < η < 10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10<n ^ 15,需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15 < η < 20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数η为5 < η < 10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下: 第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交的新探针准备同步骤I)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2XSSC中洗涤，每张切片滴加150 μ I的70%甲酰胺，70°C变性3分钟，迅速置于_20°C预冷的70%乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10 μ I新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)标本重杂交后图像采集:切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVisionRel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，SpectrumGreen , Cy3 vl, Texas Red, Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因分析。
2.根据权利要求1所述一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于:所述定量多基因荧光原位杂交方法适用于对同一细胞进行5 -20种基因分析。
3.根据权利要求1所述一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于:包括如下步骤: I)、探针制作:在常用的数据库如 NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser 和UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索含检测目的基因的BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇将连接好的DNA在_20°C进行沉淀过夜，次日离心14000rpm，4°C，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70%乙醇(4°C )，混匀，离心14000rpm，4°C，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针； 2)杂交:将要检测的标本处理好后，加入步骤I)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，85-90°C变性5分钟，47°C杂交过夜； 3)洗片，荧光显微镜检:标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA, SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果； 4)图像采集与分析: 采用Zeiss公司多色突光显微镜Axio Imager Z2型,六种滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI (SP-100), Spectrum Green (MFlOl), Cy3 vl (SP-102), Texas Red(SP_107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像； 5)检测基因个数η为I< η < 5时，采用上述步骤1)_4)即可完成检测分析，当检测基因个数η为5 < η < 10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10<n ^ 15,需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15 < η < 20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数η为5 < η < 10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下: 第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交新探针准备同步骤I)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2XSSC中洗涤，每张切片滴加150 μ I的70%甲酰胺，70°C变性3分钟，迅速置于_20°C预冷的70%乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10 μ I新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)，标本重杂交后图像采集:切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum Green , Cy3 vl, Texas Red, Cy5, PF-415六个滤光片通路中的突光信息进行米集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因(5-20种基因)分析。
6)结果判断: 特异的荧光信号应位于细胞核内，通过信号的数目和位置来判断所检测基因的正常或异变。
4.权利要求1-3任一项所述的定量多基因荧光原位杂交方法在检测基因异变中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用，利用本发明提供的方法选用的荧光素标记BAC(细菌人工染色体)探针，运用连续荧光原位杂交法即探针洗脱重杂交，每次杂交后在荧光显微镜下对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，采用计算机自动荧光视野重定位法使每张切片所采集图像精确定位于同一视野，因此可以对单个正常或肿瘤细胞同时进行5-20个基因的分析。本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。
文档编号C12Q1/68GK103114128SQ201210369888
公开日2013年5月22日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者程涛, 安德士·莱特伯格, 胡林萍, 缪为民, 袁卫平 申请人:中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)