专利名称：一种重组核糖-5-磷酸异构酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种 菌来源的核糖_5_磷酸异构酶基因(EC5. 3. I. 6,ribose- 5- phosphate isomerase, RPI)在大肠杆菌BL21 (DE3)中的可溶性表达,以及表达产物重组酶的分离纯化和在稀有糖D-阿洛糖(D-allose)的生产中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
D-阿洛糖，是D-葡萄糖的C-3位置上的差向异构体、D-阿洛酮糖的醛糖异构体。D-阿洛糖这种无毒、无卡路里、具广泛生理功能的稀有糖正成为近年来的功能性稀有糖的研究热点。D-阿洛糖的生理功能包括抑制氧化原因导致的癌症发生，并且能够抑制不同来源的癌细胞系；可以作为抗氧化剂抑制活性氧自由基造成的氧化伤害；可以抑制高钠诱 导型高血压血压的升高；可以作为抗炎剂保护局部缺血伤害、细胞冷冻的保护剂；还具有 免疫抑制作用，可用于外科手术和器官移植的保护。化学法生产D-阿洛糖需要复杂的纯化步骤，有副产物生成较多，产量较低及底物不可重复利用等缺点。D-阿洛糖的生物转化可由D-果糖经两步酶反应催化生物合成。首先由D-塔格糖-3-差相异构酶催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。生成的稀有糖D-阿洛酮糖再在酮醛异构酶的作用下转化生成D-阿洛糖。报道用于D-阿洛糖生物合成酮醛异构酶主要包括 L-鼠李糖异构酶(EC 5. 3. I. 14, L - rhamnose isomerase, L-RI),核糖-5-憐酸异构酶(EC 5. 3. I. 6, ribose-5-phosphate isomerase, RPI)和半乳糖-6-憐酸异构酶(EC5. 3. I. 26, galactose 6-phosphate isomerase, GPI)。L-鼠李糖异构酶是金属依赖性酶，催化D-阿洛酮糖和D-阿洛糖之间的转化需要Mn2+、Co2+等金属离子的参与，P.stutzeri来源的L-RhI,Z. /aciis来源的半乳糖-6-磷酸异构酶催化反应有D-阿卓糖的副产物生成。而以RPI催化D-阿洛糖的生物转化，既不需要金属离子的作用，也没有D-阿卓糖的副产物的生成，并且具有较高的催化效率。本发明通过生物信息学方法比对筛选,选取Thermotoga Iettingae核糖_5_磷酸异构酶基因为目的基因，成功构建了基因工程菌BL21 (DE3)/pET22-tlRpib，获得了可溶性表达的重组酶，具有耐热性好，PH作用范围较宽，不需金属离子辅助，没有D-阿卓糖的副产物生成等特点，具有较好的工业应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于用基因工程菌BL21 (DE3)/ pET22_ tlRpib来可溶性表达生长条件苛刻的耐热的厌氧菌Thermotoga Iettingae的核糖_5_磷酸异构酶基因获得大量重组酶，通过简单的分离纯化得到较高纯度的酶蛋白用于D-阿洛糖的酶法大规模工业生产，从而替代副产物多、分离纯化困难的化学法和其他酶法来生产具有众多生理功能的稀有糖D-阿洛糖。本发明的技术方案一种来源于的重组核糖_5_磷酸异构酶(tl-Rpib)，其基因核苷酸序列为SEQ ID N0:lo所述的重组核糖-5-磷酸异构酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。所述的重组核糖-5-磷酸异构酶的表达、分离、纯化方法，人工合成所述的核糖-5-磷酸异构酶基因序列SEQ ID NO: I (上海捷瑞生物工程有限公司，上海)来进行克隆，在序列两端顺序加上限制性酶切位点Nde I和Xho I，酶切处理后连接到载体pET-22b(+)上获得pET22- tlRpib重组质粒，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选到阳性克隆获得基因工程菌株BL21(DE3) / pET22 - tlRpib。步骤为
(1)重组表达载体pET22-tlRpib的构建
合成带Ndel/Xhol酶切位点的Thermotoga Iettingae的核糖_5_磷酸异构酶基因SEQID NO: I 连接入 pET-22b (+)得到 pET22_ tlRpib 质粒；(2)基因工程菌株BL21(DE3)/ pET22_ tlRpib的获得:
100 μ L BL21感受态细胞悬液中加入2 μ L pET22_tlRpib质粒，轻轻混匀；
冰浴静置30min，均匀涂布含100yg/mL氨苄青霉素的LB平板，37°C倒置培养12_15h得到阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21(DE3) / pET22- tlRpib ；
(3)重组tl-Rpib酶的获得
用兼性厌氧的大肠杆菌基因工程菌表达厌氧的Thermotoga Iettingae菌的核糖-5-磷酸异构酶基因Rpib，种子在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养至OD6tltlS O. 8-2时，加入O. I- 5. OmM的异丙基-β- D-硫代半乳糖苷IPTG，温度20-40°C诱导表达数小时获得重组酶的大量可溶性表达物，离心获得菌体以后超声破碎，过金属亲和层析色谱一步法得到纯度95%以上的重组核糖-5-磷酸异构酶；
挑取基因工程菌株BL21 (DE3) / pET22- tlRpib单克隆至含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB种子培养基，370C 200rpm振荡培养12h ；
以I : 50比例将种子培养液接入发酵LB培养基37°C培养至0D_=0. 8-2. 0，加IPTG至终浓度O. ImM ；
280C IOOrpm培养6h，收集菌液；4°C IOOOrpm离心IOmin收集菌体，弃去上清，生理盐水洗漆3次；
离心获得菌体以后超声破碎，按Ig菌体20mL平衡缓冲液的比例加入平衡缓冲液冰浴超声破碎细胞；超声破碎条件为，宁波新芝超声细胞破碎仪，功率200W，总时间6min，每破碎Is间歇5s。4°C IOOOOrpm离心30min去除细胞碎片；
过金属亲和层析色谱一步法得到纯度95%以上的重组核糖-5-磷酸异构酶上清离心后过Chelating Sepharose Fast Flow亲和介质层析柱,低咪唑洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，高咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；
目的蛋白过G25脱盐柱脱盐以后，超滤浓缩获得重组tl- Rpib酶液，真空冷冻干燥获得纯酶粉；
平衡缓冲液的成分PH7. 4的含20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，O. 5M NaCl缓冲液；低咪唑洗脱液的成分pH7. 4的20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，O. 5M NaCl,O. 15M咪唑缓冲液；
高咪唑洗脱液的成分pH7. 4的20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，O. 5M NaCl, O. 5M咪唑缓冲液。LB培养基的成分胰蛋白胨(bacto-trypyone) 10g/L ;酵母浸提物(yeastextract) 5g/L ；NaCl 10 g/L,蒸懼水 IOOOmL,调节 pH 至 7· 0,0. IMPa 灭菌 20min。用前加入氨苄青霉素至终浓度50 μ g /mL,固体培养基还需加I. 5%-2%的琼脂，0. IMPa灭菌20min，待冷却到50-60°C时，加入氨苄青霉素至100 μ g/mL，冷却成斜面或者平板。酶活力U定义为每分钟转化I μ mo I D-阿洛糖生成所需的酶量为I个酶活单位。本发明的有益效果本发明提供了一种核糖-5-磷酸异构酶及其编码基因序列，核糖-5-磷酸异构酶工程菌的构建及可溶性表达方法。该核糖-5-磷酸异构酶具有耐热性好，作用PH范围较宽，无需金属离子辅助，没有D-阿卓糖副产物生成等特点，对于大规模生物转化法生产稀有糖D-阿洛糖，具有广泛的重要意义。
图I重组质粒pET22-tlRpib的构建示意图。图2重组tl-Rpib酶SDS-PAGE图，第一泳道为蛋白质分子量标准，第三泳道为重组 tl-Rpib 酶。图3pH对重组tl-Rpib酶活力的影响。图4重组 tl-Rpib 的 pH 耐受性，a 为 pH8，b 为 pH7，c 为 pH6。图5温度对重组tl-Rpib酶活力的影响。图6重组tl-Rpib的温度耐受性，a为55°C，b为65°C，c为75°C，d为85°C。图7D-阿洛糖的生物转化结果。
具体实施例方式实施例I重组表达载体pET22_tlRpib的构建与基因工程菌株BL21(DE3) /pET22- tlRpib 的获得
合成带Ndel/Xhol酶切位点的Thermotoga Iettingae的核糖_5_磷酸异构酶基因435bp 连接入 pET-22b ( + )得到 pET22_ tlRpib 质粒。100 μ L BL21感受态细胞悬液中加入2 μ L pET22_tlRpib质粒，轻轻混匀。冰浴静置30min，均匀涂布含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板，37 °C倒置培养12-15h得到阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21(DE3) / pET22- tlRpib。对重组质粒pET22_tlRpib进行测序，结果表明插入片段为一个含有435bp的DNA片段，编码145个氨基酸组成的蛋白质。实施例2重组tl-Rpib酶的获得
挑取基因工程菌株BL21(DE3) / pET22- tlRpib单克隆至含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB种子培养基，370C 200rpm振荡培养12h。以I : 50比例将种子培养液接入发酵LB培养基37°C培养至0D600=0. 8-2. 0，加IPTG至终浓度0. ImM。28°C IOOrpm培养6h,收集菌液。4°C IOOOOrpm离心IOmin收集菌体，弃去上清，
生理盐水洗涤3次。按Ig菌体20mL平衡缓冲液的比例加入缓冲液超声破碎细胞，上清离心后过Chelating Sepharose Fast Flow亲和介质层析柱,低咪唑洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，高咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。平衡缓冲液的成分pH7. 4的含20mM磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钠，O. 5M NaCl缓冲液。低咪唑洗脱液的成分pH7. 4的20mM磷酸氢ニ钠_磷酸ニ氢钠,O. 5M NaCl, O. 15M咪唑缓冲液。高咪唑洗脱液的成分pH7. 4的20mM磷酸氢ニ钠_磷酸ニ氢钠，O. 5M NaCl, O. 5M咪唑缓冲液。目的蛋白过G25脱盐柱脱盐以后，超滤浓缩获得重组tl- Rpib酶液，真空冷冻干燥获得纯酶粉。 15%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白，见图2。实施例3 pH对重组tl-Rpib酶活力的影响
底物D-阿洛酮糖浓度50mM，反应温度65°C，反应时间15min，分别以三种缓冲体系，柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH5-5. 5)，磷酸盐缓冲液(50 mM,pH 6. 0-7. 5)和Tris盐酸缓冲液(50mM,pH 8. 0-9. O)进行反应。重组tl-Rpib酶的最适pH值为8，在pH6_9之间可保留最大酶活的80%，见图3。将重组tl-Rpib酶粉溶于pH值分别为6，7，8的磷酸缓冲液，室温放置一定时间，酶液调节pH至8，并定容，检测其酶活。图4显示，重组tl-Rpib酶在pH8时稳定性较好，室温放置24h后保持60%的酶活。实施例4温度对重组tl-Rpib酶活力的影响
底物D-阿洛酮糖浓度50mM，pH8磷酸缓冲液中不同温度下反应15min。重组tl-Rpib酶的最适温度为75°C，见图5。将重组tl-Rpib酶于pH 8的磷酸缓冲液中，分别置于不同温度下保温一定时间再于最适温度反应测定酶活。图6显示，重组tl-Rpib酶比较耐热，75°C半衰期为3h。实施例5 D-阿洛糖的生物转化
酶反应缓冲液采用50mM的pH8. O的磷酸缓冲，底物D-阿洛酮糖为IOOmM,按20U/g底物的比例加入酶粉，在酶反应器中55°C反应12h，加浓HCl至终浓度200mM终止反应。用高效液相色谱法检测产物组成，色谱柱为HPLC Waters Sugar-Pak I，检测器为示差折光检测器，柱温85°C，流动相为纯水，流速O. 4mL/ min。反应液中含有31%的D-阿洛糖和69%的D-阿洛酮糖，即该酶催化D-阿洛糖和D-阿洛酮糖之间的酮醛异构化反应最后达到31 69的平衡，见图7。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置換方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.ー种来源于Thermotoga Iettingae的重组核糖_5_磷酸异构酶tl-Rpib,其基因核苷酸序列为SEQ ID NO: I。
2.根据权利要求I所述的重组核糖-5-磷酸异构酶，其氨基酸序列为SEQID N0:2。
3.权利要求I所述的重组核糖-5-磷酸异构酶的表达、分离、纯化方法，其特征在于人工合成基因SEQ ID N0:1，两端设计Nde I和Xho I限制性内切酶识别序列，酶切处理后连接到载体pET-22b (+)上获得pET22- tlRpib重组质粒，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选到阳性克隆获得基因工程菌株BL21 (DE3) /pET22-tlRpib ;步骤为 Cl)重组表达载体pET22-tlRpib的构建 合成带Ndel/Xhol酶切位点的Thermotoga Iettingae的核糖_5_磷酸异构酶基因SEQID NO: I 连接入 pET-22b (+)得到 pET22_ tlRpib 质粒； (2)基因工程菌株BL21(DE3)/ pET22_ tlRpib的获得: .100 μ L BL21感受态细胞悬液中加入2 μ L pET22_tlRpib质粒，轻轻混匀； 冰浴静置30min，均匀涂布含100yg/mL氨苄青霉素的LB平板，37°C倒置培养12_15h得到阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21(DE3) / pET22- tlRpib ； (3)重组tl-Rpib酶的获得 用兼性厌氧的大肠杆菌基因工程菌表达厌氧的Thermotoga Iettingae菌的核糖-5-磷酸异构酶基因Rpib，种子在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鮮的含氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养至OD6tltl为O. 8-2时，加入O. I- 5. OmM的异丙基-β- D-硫代半乳糖苷IPTG，温度20-40°C诱导表达数小时获得重组酶的大量可溶性表达物，离心获得菌体以后超声破碎，过金属亲和层析色谱一歩法得到纯度95%以上的重组核糖-5-磷酸异构酶； 挑取基因工程菌株BL21 (DE3) / pET22- tlRpib单克隆至含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB种子培养基，370C 200rpm振荡培养12h ； 以I : 50比例将种子培养液接入发酵LB培养基37°C培养至0D_=0. 8-2. 0，加IPTG至终浓度O. ImM ； .280C IOOrpm培养6h，收集菌液；4°C IOOOrpm离心IOmin收集菌体，弃去上清，生理盐水洗漆3次； 离心获得菌体以后超声破碎，按Ig菌体20mL平衡缓冲液的比例加入平衡缓冲液冰浴超声破碎细胞；超声破碎条件为，功率200W，总时间6min，每破碎Is间歇5s ；4°CIOOOOrpm离心30min去除细胞碎片； 过金属亲和层析色谱一歩法得到纯度95%以上的重组核糖-5-磷酸异构酶上清离心后过Chelating Sepharose Fast Flow亲和介质层析柱,低咪唑洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，高咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白； 目的蛋白过G25脱盐柱脱盐以后，超滤浓缩获得重组tl- Rpib酶液，真空冷冻干燥获得纯酶粉； 平衡缓冲液的成分PH7. 4的含20mM磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钠，O. 5M NaCl缓冲液； 低咪唑洗脱液的成分pH7. 4的20mM磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钠，O. 5M NaCl,O. 15M咪唑缓冲液；高咪唑洗脱液的成分pH7. 4的20mM磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钠，O. 5M NaCl, O. 5M咪唑缓冲液。
4.用权利要求I所述的重组核糖-5-磷酸异构酶转化D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的方法，其特征在于底物D-阿洛酮糖浓度lO-lOOmM，tl-Rpib酶添加量为2_20U/g底物，pH6_9，转化反应温度50-85°C，转化时间3-24h，得到含有D-阿洛糖的酶反应液。
全文摘要
一种重组核糖-5-磷酸异构酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明构建了重组表达载体pET22-tlRpib，获得了基因工程菌株BL21(DE3)/pET22-tlRpib。发酵获得了重组Thermotogalettingae核糖-5-磷酸异构酶，用ni2+亲和柱进行分离纯化得到了纯度95%以上的重组酶tl-Rpib。该重组酶催化D-阿洛酮糖与D-阿洛糖之间的酮醛异构化反应生产D-阿洛糖，反应达到平衡以后转化率可达31%。该酶具有良好的耐热性，不需要金属离子参与催化反应，产物分离纯化难度小，在较宽的pH(6-9)范围内能保持80%以上的最大酶活,可以应用于稀有糖D-阿洛糖的大规模工业化生产。
文档编号C12N15/70GK102839184SQ201210369010
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者江波, 沐万孟, 冯再平, 张涛 申请人:江南大学