专利名称：家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术、蛋白质分析技术，尤其涉及一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法。
背景技术：
蝎毒素蛋白是由细胞产生的一类具有对昆虫具有毒性的蛋白质，可应用于农业害虫的杀灭，但该蛋白质不稳定，在环境中易被分解而失去活性。家蚕杆状病毒中的核型多角体病毒在感染宿主后的晚期能够产生大量的多角体蛋白，并聚合形成一种独特的超大分子蛋白质结晶——多角体。目前的研究表明多角体的功能主要保护包埋在多角体内部的病毒粒子，使之长时间保存活性。
本发明利用这一现象，利用野生型病毒表达多角体，同时构建了表达蝎毒素蛋白基因的病毒载体，将两种病毒同时感染家蚕培养细胞，这样野生型病毒产生多角体，在细胞内会将蝎毒素蛋白包埋和固定入多角体内部。这样解决了蝎毒素蛋白容易失活的缺点，为开发蝎毒素蛋白作为生物杀虫剂创造了条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法。它利用基因工程表达技术，构建含有蝎毒素蛋白基因的重组病毒，并利用家蚕培养细胞作为宿主，重组病毒与野生型病毒共感染细胞，使蝎毒素蛋白被固定于多角体内部。为了达到上述目的，本发明采用的具体技术方案为
本发明家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法包括
(1)按以下方法进行蝎毒素蛋白基因的克隆
以从蝎子抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增反应得到蝎毒素蛋白BmK基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下正向引物为含有酶切位点的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG 3’，反向引物为含有历/ dIII酶切位点的5’AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’ ；所述RT-PCR扩增反应为一个循环,94° C模板变性3分钟；接着30个循环，94° C变性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分钟；最后I个循环,72。C延伸10分钟；
利用1%琼脂糖凝胶电泳对所述蝎毒素蛋白ifc成基因进行PCR产物分析和纯化，随后将目的PCR产物克隆进TA载体pCR2. I，得到pCR2. I-BmK基因，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认所述PCR2. I-BmK基因的顺序的正确性；
(2)用限制性内切酶和历/ (1111消化所述pCR2.基因得到基因片段，然后将谷〃成基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；
按以下方法将所述重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒
在聚苯乙烯锥形管中按1:15的质量比加入所述重组的转移载体的DNA和家蚕BmNPV的DNA,并在加入脂质体Iipofectin后混勻，最后加入灭菌蒸懼水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总体积与其中的所述脂质体Iipofectin的体积比为20 7 ;将所述混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再用含有10%胎牛血清的新鲜培养基在27°C条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，对所述病毒储存原液进行空斑筛选而获得含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒；
(3)使用家蚕培养细胞，接种所述含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV,在27°C下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。本发明与现有技术相比，具有的有益效果是
本发明解决了蝎毒素蛋白在蛋白游离状态下容易被分解而失活的缺点，利用野生型病毒产生的多角体将重组蝎毒素蛋白固定在其内部，使蝎毒素蛋白受到保护。这样的技术为开发蝎毒素蛋白作为生物杀虫剂创造了条件。
图I :杆状病毒转移载体pBlueBacHisa的图谱；
图2 :在家蚕培养细胞中病毒表达产生的多角体(普通显微镜下观察)；
图3 =SDS-PAGE电泳分析多角体蛋白。
具体实施例方式以下实施例涉及的相关材料及其来源如下
(I)家蚕野生型病毒BmNPV :由浙江大学动物科学学院蚕蜂研究所提供。(2) RNA抽提试剂盒购于Qiagene。(3) DNA 处理和 PCR 扩增试剂盒购于 Tkfcara OffietZicaJ1S (Kyoto, Japan)。(4) TA克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pBlue BacHisa和Iipofectin :均为美国In vi trogen公司产品。(5) DNA 测序试剂盒购于/ 1 Applied Biosysterns。(6)胎牛血清FCS、家蚕培养细胞培养基TC-100 :均为GibcoBRL的产品。
以下以具体实施例详细说明本发明家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法，它包括如下部分
(I)竭毒素蛋白ifcz/T基因的克隆
以蝎子抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到蝎毒素蛋白基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下正向引物为含有酶切位点的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG3’ ；反向引物为含有历fldIII酶切位点的5’AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’。所述RT-PCR扩增反应为一个循环，94° C模板变性3分钟；接着30个循环，94° C变性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分钟；最后I个循环，72° C延伸10分钟。利用I %琼脂糖凝胶电泳对所述蝎毒素蛋白基因进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进TA载体pCR2. 1，得到pCR2. I-BmK基因，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认PCR2. I-BmK克隆基因顺序的正确性。pCR2. I-BmK基因的序列如SEQ ID NO: I所示。(2)含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒的构建
用限制性内切酶和历/ (1111消化pCR2. 基因得到基因片段，然后将基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体，杆状病毒转移载体pBlueBacHisa的图谱参见图I。按以下方法将所得到的重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒
在聚苯乙烯锥形管中加入I μ g转移载体DNA和15 μ g家蚕BmNPV DNA,并加入14U I脂质体Iipofectin后混勻，最后加入灭菌蒸懼水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总体积达到40 μ I ;将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再用含有10%胎牛血清的新鲜培养基在27°C条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液以用来 筛选重组病毒；重组病毒通过三轮空斑筛选，获得浓度为IO8 pfu/ml的病毒溶液，该病毒溶液命名为含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒。(3)家蚕培养细胞内表达
使用家蚕培养细胞，接种以上得到的含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV，在27°C下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞，从而在家蚕BmNPV多角体晶体内固定蝎毒素蛋白。(4)多角体晶体固定蝎毒素蛋白的分析鉴定将上述离心收集到的家蚕培养细胞样品进行超声波破碎，释放细胞内的多角体，然后利用蛋白质SDS-PAGE电泳的技术，对固定入多角体内的重组蝎毒素蛋白进行鉴定。在家蚕培养细胞中病毒表达产生的多角体参见图2。经过溶解多角体蛋白并通过电泳分析，如图3所示，在多角体蛋白条带，还能检测到一条分子量较小、大小约为13.8 KDa的蛋白条带，与预测的重组蝎毒素蛋白分子量大小一致，证明这是重组蝎毒素蛋白BmK，这说明除多角体蛋白外，多角体内还含有蝎毒素蛋白，这一结果表明利用多角体固定蝎毒素蛋白成功。
权利要求
1.一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法，其特征在于包括 (1)按以下方法进行蝎毒素蛋白基因的克隆 以从蝎子抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增反应得到蝎毒素蛋白BmK基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下正向引物为含有酶切位点的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG 3’，反向引物为含有历/ dIII酶切位点的5’AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’ ；所述RT-PCR扩增反应为一个循环,94° C模板变性3分钟；接着30个循环，94° C变性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分钟；最后I个循环,72。C延伸10分钟； 利用1%琼脂糖凝胶电泳对所述蝎毒素蛋白ifc成基因进行PCR产物分析和纯化，随后将目的PCR产物克隆进TA载体pCR2. I，得到pCR2. I-BmK基因，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认所述PCR2. I-BmK基因的顺序的正确性； (2)用限制性内切酶和历/ (1111消化所述pCR2.基因得到基因片段，然后将谷〃成基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体； 按以下方法将所述重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒 在聚苯乙烯锥形管中按1:15的质量比加入所述重组的转移载体的DNA和家蚕BmNPV的DNA,并在加入脂质体Iipofectin后混勻，最后加入灭菌蒸懼水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总体积与其中的所述脂质体Iipofectin的体积比为20 7 ;将所述混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再用含有10%胎牛血清的新鲜培养基在27°C条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，对所述病毒储存原液进行空斑筛选而获得含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒； (3)使用家蚕培养细胞，接种所述含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV,在27°C下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法，包括(1)进行蝎毒素蛋白BmK基因的克隆；(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII消化所述pCR2.1-BmK基因得到BmK基因片段，然后将BmK基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；将所述重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPVDNA共转染入家蚕培养细胞，并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒；(3)使用家蚕培养细胞，接种所述含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV，在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。本发明解决了蝎毒素蛋白容易失活的缺点，为开发蝎毒素蛋白作为生物杀虫剂创造了条件。
文档编号C12N15/866GK102911968SQ20121036863
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者王国宝, 沈运旺, 吴小锋 申请人:浙江大学