专利名称：杀菌通透性增强蛋白基因作为猪一般抗病力遗传标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于猪遗传育种及分子标记辅助选择技术领域，具体涉及猪一般抗病力遗传标记的筛选和应用。
背景技术：
随着集约化饲养管理方式的普及，在养猪业生产中，疾病的危害极易给畜牧业生产带来重大损失。在美国，每年由于猪病而付出的费用超出15亿美元。这一巨大的经济损失主要是由于猪只死亡、生产效率降低、医药费用增加以及产品损失造成的。在应激的生产条件下，对重要经济性状施加的选择压，也会导致疾病发生率的增加。疾病会使选择的效率降低，影响生产性状的遗传改进。目前，对畜禽疾病的控制措施，主要是采用疫苗接种和抗菌素类药物治疗，然而，由于病菌类型繁多且变化快，疫苗的使用并不总是有效，同时滥用抗菌素会导致畜产品携带大量残留药物，成为药物食品(Drug-food)，对人类的健康产生不良影响，现在许多国家纷纷开始禁止进口药物食品和限制抗菌素在畜禽治疗中的应用，因此在培育高产品种的同时，寻找一条安全可靠且经济可行的畜禽疾病防治途径，己是科学家和畜牧生产者共同 关心的紧迫问题。为了获得更多的疾病防治方法，必须清楚地了解动物的免疫抗病系统及致病机理。疾病的发生一般是动物的遗传背景与其所处环境之间相互作用的结果。若某一动物在遗传上对一种疾病易感，则环境条件(包括常规疾病防治方法)可能仅对疾病的防治部分有效。一个可取代疾病常规防治法是针对提高家畜抗病力进行选择性育种。遗传性抗病力包括了机体免疫抗病系统及其相互作用的许多方面，因而极为复杂。目前从根本上开展猪的抗性遗传机制研究，进行抗病育种，已引起了国内外学者的高度重视。病原体在传染过程中，会遇到3道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制。当个体受到病原体侵染时，会调动这3方面的防御机制加以抵抗。猪是否发病取决于侵染和防御机能相互作用的结果，防御机能加强的猪便表现出自然抗病力。抗病力按遗传基础的不同可分为特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指猪对某种特定疾病或病原体的抗性，这种抗性主要受一个主基因位点控制，同时也可不同程度地受其它位点(包括调控子)及环境因素影响。现有的研究结果表明，特殊抗病力的内在机理在于宿主体内存在或缺少某种分子或其变体，这不仅能决定异体识别及特异性异体反应，还能决定病原体的特殊附着力，病原体进入体内后在体内增殖，能否导致宿主发病。一般抗病力不限于抗某一种病原体，它受多基因和环境的综合影响，病原体的抗原性差异对一般抗病力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能。研究发现，不少猪病的发病机制与猪本身的遗传背景有关，即猪可能对一些疾病存在完全或部分抗性。广义上讲，任何疾病的发生都是遗传与环境因素共同作用的结果，几乎所有疾病都与遗传有关。狭义上讲，遗传病是由于生殖细胞或受精卵中遗传物质发生了结构或功能上的变异所致。因此，从长远角度来看，采用遗传学方法从遗传基础上提高猪对疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是维持猪在不良环境中生存和生产的必要条件，因此培育具有一般抗性的猪种成为育种领域的主要课题之一，筛选和确定猪一般抗病力的遗传标记已成为培育具有一般抗性猪种的当务之急和关键所在。细胞因子在机体免疫应答过程中发挥了重要的辅助性作用，IL-2能够促进T、B细胞的增殖，在抗肿瘤、抗毒素及免疫调节方面发挥了重要的作用；IL_4能够诱导MHC-1I类抗原的表达，并增强其对肿瘤细胞和寄生虫的杀伤性；IL-6能够促进IL-2及其受体的表达，在免疫应答调节及造血过程中起到重要作用；IL-10是一个抗炎性因子，参与机体天然免疫的调节；IL_12主要在细胞免疫和I型细胞介导的抗肿瘤免疫中起作用；IFN-Beta能够抑制病毒蛋白的合成，诱导MHC-1类抗原的增加，从而调剂机体的免疫功能。上述重要细胞因子的水平是机体免疫应答能力和一般抗病力的重要标志。杀菌通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-1ncreasingprotein, BPI)是人和哺乳动物的内源性阳离子蛋白质，主要存在于多形核白细胞(Ploymorphneclearleukocytes, PMNs)的嗜苯胺蓝颗粒中。BPI除了能杀灭G-菌，中和内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的活性外，还有调理功能、促进补体活化，增强吞卩遼的调理功能、抑制血管生成、抑制炎性介质释放、抗真菌和原虫等一系列生物学功能，在动物机体天然防御中起到了很重要的作用。具有生物活性的BPI是LPS的天然抑制物，而LPS可以激活单核吞噬细胞系统释放细胞因子(如TNFa、IL6、IL2等)，引起全身炎症反应，故BPI基因可以间接影响部分免疫指标水平，是研究动物抗病育种的重要候选基因。国内外关于猪BPI基因的多态性及其对疾病的抗性/易感性相关的研究鲜见报道，在美国专利网中有一段关于猪BPI基因的序列，长1452bp，没有清楚的注释，现将其命名为专利 BPI 序列(United States, Kind Code:Al, Patent Application:20040234980)。在此专利的公开信息中，Christopher等在约克、汉普夏、杜洛克、长白、大白、野猪和眉山猪中，检测到BPI基因外显子4和10分别存 在Ava II和HpaII酶切多态性，通过攻毒试验表明其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关，并把BPI基因确立为抗沙门氏菌病育种候选基因。
发明内容
本发明是用BPI基因外显子4和10多态位点组合基因型作为猪一般抗病力的分子标记及其检测方法与应用。检测该分子标记的方法包括待测样品的猪基因组DNA的提取及其PCR扩增，外显子4的PCR产物经SSCP分析和外显子10的PCR产物经限制性内切酶Hpa II的酶切，当待测猪个体基因型为CDAB型(外显子4的PCR产物经SSCP分析出现4条带且外显子10的PCR产物经限制性内切酶Hpa II酶切出现445bp/304bp/ 142bp条带)，则为一般抗病力强的个体。其中，外显子4的引物A如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示；外显子10的引物B如 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示。本发明为从遗传素质上永久性地提高仔猪一般抗病力和免疫应答能力提供了有效的分子标记。本发明的优点体现在:I)本发明为猪抗病育种工作的分子标记辅助选择提供一个更加高效准确的分子遗传标记，为提高仔猪一般抗病力提供了一种有效的分子标记育种手段。用该遗传标记对猪一般抗病力进行标记辅助选择，猪抗逆性入手开展抗病育种，提高猪的免疫应答能力，可以更有效地解决猪很多疾病如呼吸道疾病与环境相互作用的问题，从根本上降低诸多疾病的发病率。2)使用2个变异位点的组合基因型作为标记，基因聚合效应并不是各个位点效应的简单相加，合并基因型效应高于单个基因型效应，为加速改善仔猪抗病能力的分子育种奠定了基础，将加快育种进程。3)本发明的检测方法操作简单，费用较为低廉，准确度高，并可实现自动化的直接检测，本发明将在猪的育种中发挥巨大作用。
图1为BPI基因 第4外显子PCR扩增产物的SSCP分析图；其中第I泳道为DD基因型；2-3泳道为CC基因型；4-5泳道为⑶基因型。图2为BPI基因第10外显子酶切后3种基因型的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中M为 pUC19DNA/MSp I (HapII)marker，第 2、6、8、11、12 泳道为 AA 基因型；第 4、10 泳道为 BB基因型，第1、3、5、7、10泳道为AB基因型。
具体实施例方式一、利用BPI基因第4外显子和第10外显子变异位点标记对苏太猪核心群全面检测基因型。每个个体采耳组织块约1.0g,放入1.5mL的Eppendoff管内于冰盒中取回扬州大学动物遗传育种与繁殖重点学科实验室备用。按常规酚-氯仿法提取DNA。提取的DNA用核酸蛋白测定仪测定其含量和纯度，-20°C保存备用。通过NCBI的 BLAST 找到猪的 21 条染色体的mapview,经过blast search againstpig sequences,找一段refseq序列(非冗余的)BPI mRNA序列EF436278并选择高通量测试数据库(HTGS)，从而找到一条同源性达到99%的序列，这一段是包含BPI全序列的高通量测试序列，序列号为FP339579.2，但并未注释。然后通过NCBI上的spidey进行非冗余的mRNA与此高通量结果比对就可以得出BPI共有15个外显子的全部信息，然后选取外显子4和10等序列,利用Primer Premier5.0软件进行引物设计(表I)。表IBPI基因外显子4和10引物设计
权利要求
1.杀菌通透性增强蛋白基因作为猪一般抗病力遗传标记的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于具体包括以下步骤: (I)提取待测样本的耳组织DNA，备用； (2 ) PCR扩增:以步骤(I)的DNA为模板，用下述引物A和引物B分别进行PCR扩增， 引物A: 上游引物为:5’ -TCAGGTTGGTTACCGCAGAG -3’ 下游引物为:5’ -ACCCTGTTGATGTGGCTTCT -3’ 引物B: 上游引物为:5、CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3^ 下游引物为:5'CAATGAATCAATGAGCACACC -3λ ； (3)引物A的PCR扩增产物用SSCP方法进行分析，引物B的PCR扩增产物用限制性内切酶//酶切后经聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析，选择引物A扩增产物出现4条带且同时引物B扩增产物出 现445 bp/304 bp/142 bp条带的样本为一般抗病力强的个体。
全文摘要
本发明涉及筛选一种猪一般抗病力BPI基因第4和10外显子变异位点组合基因型的遗传标记，属于猪遗传育种及分子标记辅助选择技术领域。本发明方法包括待测样品的猪基因组DNA的提取及其PCR扩增，外显子4的PCR产物经SSCP分析和外显子10的PCR产物经限制性内切酶HpaII的酶切，当待测猪个体基因型为CDAB型，则为一般抗病力强的个体。本发明为猪抗病育种工作的分子标记辅助选择提供一个更加高效准确的分子遗传标记，为提高仔猪一般抗病力和免疫应答能力提供了一种有效的分子标记育种手段，本发明的检测方法操作简单，费用较为低廉，准确度高，并可实现自动化的直接检测，本发明将在猪的育种中发挥巨大作用。
文档编号C12Q1/68GK103173531SQ20121036986
公开日2013年6月26日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者包文斌, 吴圣龙, 潘章源, 吴正常, 霍永久, 朱国强, 黄小国, 黄雪根, 陈洪青, 孙寿永 申请人:扬州大学