专利名称：一种微生物培养基及培养方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种微生物培养基及培养方法。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids PUFA)是指含有两个或两个以上双键，且碳链长为16 22个碳原子的直链脂肪酸，是细胞和有机体生物膜的重要组成成分，可调节细胞构型、动态平衡，保持细胞膜的相对流动性，以保持细胞的正常生理功能，因此可影响细胞的化学组成、信号传递、免疫等功能，从而与相关疾病的发生关系重大，PUFA在人体内具有重要的生理调节功能，包括使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯，降低血液粘度，改善血液微循环，提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力等。多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等，DHA具有预防和治疗心血管疾病、改善血液粘度和提高红细胞变形能力、预防和治疗癌症、抗血栓、抗炎等作用，DHA是人 脑的主要组成物质之一，对婴儿大脑的正常发育以及成人大脑功能的正常发挥有着非常重要的作用，研究证明DHA的缺乏会导致大脑功能降低，因此专家建议成年人及孕妇和需要补充富含PUFA的食物，如海鱼等用以适量补充，DHA是很好的医药和营养食品成分。鉴于PUFA的重要功能与作用，目前广泛受到医疗界和食品界的关注。传统制备PUFA的商业来源是从鱼油中进行分离，但从鱼油中提取PUFA含有强烈的鱼腥味，而且资源有限，产量不稳定，鱼油中W-3多不饱和脂肪酸的含量因鱼的种类、捕捞的季节、气候和地点的不同而存在着差异，鱼油产量波动很大，且纯化工艺复杂，产品得率低，同时产品需求量大导致的某些为了商业利益而不计后果的过量捕捞行为的出现，给环境资源保护带来了不利影响，因此传统的鱼油制备法不能满足社会的需求。目前已发现可以利用微生物来生产PUFA，且已有诸多研究报道，特别是利用藻类发酵法生产DHA等多不饱和脂肪酸已成为目前学者的研究热点，该方法不受季节、地域等条件限制，脂肪酸含量高且组分单一，大大简化了纯化工艺并降低了精制难度，培养条件比较容易控制，进而为控制脂质含量和组成提供了可能，利用微生物发酵法生产DHA等多不饱和脂肪酸还可以减少因市场需求而大量捕捞带来的对环境资源的影响，对环境资源的保护也具有重要的意义。微生物发酵法生产多不饱和脂肪酸可以实现对培养条件，如温度、溶氧、pH等的操作控制，从而更易实现培养过程及产品品质的可控性和稳定性。在发酵过程中经常出现的问题是，由于代谢产物的出现和/或某种培养基成分被消耗，发酵培养过程中PH会出现剧烈的波动，在这样的情况下，而如果在微生物发酵过程中不对pH进行适当的调控，细胞代谢速率及生长状况就会受到影响，甚至停止生长，因此，微生物的发酵培养需要调节pH。目前研究成果中，微生物发酵生产多不饱和脂肪酸发酵过程pH调控方法普遍为采用外部设备向发酵体系中补充酸碱液来进行调节，此方法虽在一定程度上可以将发酵PH控制在恒定范围，但也存在一定问题，例如增加发酵过程设备投入，灭菌过程及人工能耗，而最为严重的是增加了可能带入其他微生物导致发酵过程染菌的隐患，在微生物发酵培养中，一旦染菌，将对产品稳定生产造成巨大影响和经济损失。除了采用外部设备之外，近些年来，通过对培养基成分进行调整使其自身具备一定的PH调节能力也成为了微生物发酵中的对pH进行调控一个研究方向和有效手段。这些方法主要可分为以下几类(I)在培养基中加入强碱弱酸盐。CN101538592B公开了一种用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法，其在培养基中添加谷氨酸钠，在发酵过程中不调节pH ；CN101519676B公开了一种用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法，其在培养基中添加谷氨酸钠，并且在发酵过程中还补充柠檬酸以调节pH ；CN1218035C公开了一种利用海洋微藻异养培养生产长链多不饱和脂肪酸，其在培养基中添加谷氨酸钠，在发酵过程中不调节pH ；CN101591617B公开了一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用，其在培养基中添加谷氨酸钠与碳酸氢钠，在发酵过程中不调节pH。在这些采用培养基中氮源添加谷氨酸钠等强碱弱酸盐的方法中，强碱弱酸盐在被细胞消耗后导致发酵过程 PH出现显著上升，而pH过高时会严重影响和改变细胞代谢过程，进而导致发酵过程减产，而当需要外部设备补充酸液调节PH时，不但增加设备投入，同时还存在染菌风险。(2)在培养基中加入添加无机铵盐等强酸弱碱盐。CN 101528939B公开了使用改良的培养基从破囊壶菌目菌群生产ω-3脂肪酸，在发酵过程中补加氢氧化钠调节pH;CN101812484A公开了一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，在发酵过程中补充氨水调节pH ;Richard B. Bailey等人的一系列专利分别公开了通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生的方法，在发酵过程中，补充氨水调节pH。在这些采用培养基中氮源添加无机铵盐等强酸弱碱盐的方法中，强酸弱碱盐消耗后导致发酵过程PH出现显著下降。pH过低时将导致发酵体系酸败，可严重影响和改变细胞代谢过程，进而导致发酵过程减产，同时强酸环境对发酵设备损害严重，不利于利用微生物大规模和长期稳定生产不饱和脂肪酸。若在发酵过程中补加碱液或其他高PH溶液来调节，则增加了设备投入，并且存在染菌风险。此外，CN1914327A公开了一种培养THRAUSTOCHYTRIALES属微生物的方法，其采用在培养基中添加碳酸钙来调控和稳定发酵过程pH。但是由于碳酸钙在发酵过程中形成的二氧化碳在水中只有有限的溶解度，从而导致该缓冲体系在发酵过程中缓冲能力的降低。因此本领域需要新的培养基方案以实现发酵过程中pH的高效稳定控制。
发明内容
本发明提供了一种微生物培养基方案，用以解决发酵培养过程pH升高或下降波动对细胞生长的影响，减少或消除了发酵培养过程通过外部设备进行酸碱调节的操作，以及由此带来的发酵过程染菌隐患，此培养基方案通过营养物质的组合将培养过程PH控制在恒定范围内，实现发酵培养过程pH的简便和高效调控，对微生物发酵生产不饱和脂肪酸规模化生产意义重大。为达此目的，本发明采用以下技术方案在第一方面，本发明提供了一种培养基，所述培养基中包含强酸弱碱盐与弱酸强碱盐的组合以在发酵过程中控制PH，其中，所述强酸弱碱盐为有机及无机强酸铵盐，优选地为硝酸铵或硫酸铵，氯化铵，草酸铵，更优选地为硫酸铵，所述弱酸强碱盐为碳酸或氨基酸的钠盐、钾盐或钙盐。在本发明的培养基中，所述强酸弱碱盐与弱酸强碱盐的组合可以用于将所述培养基的pH控制为4. 0-9. 0，优选地5. 0-8. 0，最优选地6. 0-7. O。在本发明的培养基中，所述氨基酸的钠盐、钾盐或钙盐可以是谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸的钠盐、钾盐或钙盐或者其至少2种的混合物。在本发明的培养基中，所述弱酸强碱盐可以为谷氨酸钠。在本发明的培养基中，谷氨酸钠的含量可以为l_20g/L，优选为5_15g/L，更优选为8-12g/L，最优选为10g/L。
在本发明的培养基中，硫酸铵的含量可以为O. 5_5g/L，优选为l_4g/L，更优选为2-3. 5g/L，最优选为 3g/L。本发明的培养基还可以包含其他氮源、碳源、无机盐和微量元素；优选的，所述碳源为废糖蜜、甘蔗汁、玉米粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、二氧化碳或其至少2种的混合物；优选的，所述氮源为有机氮化合物、无机氮化合物或其混合物；优选的，所述无机盐包括钠盐、镁盐、钾盐、铁盐、钙盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐或其至少2种的混合物；和/或，优选的，所述微量元素包括维生素BI、维生素B6、维生素B12、维生素H、6_苄氨基腺嘌呤(6-BA)或其至少2种的混合物。在本发明的培养基中，所述有机氮化合物包括酵母提取物、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、氨基酸、谷氨酸钠或其至少2种的混合物。在本发明的培养基中，所述无机氮化合物包括尿素、亚硝酸盐、硝酸盐、无机铵盐或其至少2种的混合物。本发明的培养基可以包含葡萄糖10_200g/L，谷氨酸钠l_20g/L，硫酸铵O. 5_5g/L，酵母膏浓度为碳源浓度的1/2-1/10，优选地5-20g/L，所述无机盐，以钠盐为标准，
O.l_35g/L，所述微量元素中维生素BI浓度10-30ppm，维生素B6浓度5_15ppm，维生素B12浓度l-5ppm,维生素H浓度l_5ppm, 6-BA浓度3_15ppm。本发明的培养基的pH 可以为 4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5 或
9.O ο本发明的培养基中谷氨酸钠含量可以为lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、llg/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L 或 20g/L0本发明的培养基中硫酸铵的含量可以为O. 5g/L、l. Og/LU. 5g/L、2. 0g/L、2. 5g/L、
3.0g/L、3. 5g/L、4. 0g/L、4. 5g/L 或 5. Og/L。本发明的培养基中葡萄糖的含量可以为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、I10g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L 或 200g/L。本发明的培养基中酵母膏的含量可以为lg/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L 或 100g/L。本发明的培养基中无机盐的含量(以钠盐为标准)可以为O. lg/L,O. 5g/L、lg/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L 或 35g/L。本发明的培养基中维生素BI的浓度可以为lOppm、15ppm、20ppm、25ppm、或30ppm。本发明的培养基中维生素B6的浓度可以为5ppm、8ppm、lOppm、12ppm、或15ppm。本发明的培养基中维生素B12的浓度可以为lppm、2ppm、3ppm、4ppm、*5ppm。本发明的培养基中维生素H的浓度可以为lppm、2ppm、3ppm、4ppm、*5ppm。本发明的培养基中维生素6-BA的浓度可以为3ppm、6ppm、9ppm、12ppm、或15ppm。 在另一个方面,本发明提供了一种在微生物的培养方法,所述方法包括在发酵过程中采用如第一方面所述的培养基。在本发明的培养方法中，所述微生物为微藻。本发明的培养方法可包括在摇瓶预培养、一级种子培养、二级种子培养和/或三级发酵培养中采用第一方面所述的培养基。本发明的培养方法可包括a)活化培养，将藻种采用斜面或平板划线，于25°C恒温培养3_5天，挑取形态饱满、生长旺盛的藻落，再次进行斜面或平板划线，于25°C恒温培养3-5天；b)摇瓶预培养，挑取活化的藻落接种于洁净摇瓶中，25°C，150_300rpm，优选150-250rpm,最优选200rpm下振荡培养；c)发酵放大培养，其中将摇瓶预培养获得的藻种接入一级种子罐，接种量2%_10%，优选4%-8%，最优选6%，通入无菌空气并搅拌，通气量O. 4-1. Ovvm,优选O. 5-0. 8vvm,最优选
O.7vvm,搅拌速度100-300rpm，优选150_250rpm，最优选200rpm，控制培养温度在24_28°C，优选25-27°C，最优选26°C，进行一级种子培养；将一级种子罐内发酵种子液接种至二级种子罐，接种量5%-15%，优选7%-13%，最优选10%，通入无菌空气并搅拌，通气量O. 4-1. Ovvm,优选 O. 5-0. 8vvm,最优选 O. 7vvm,搅拌速度 100-300rpm,优选 150-250rpm,最优选 200rpm,控制培养温度在24-28°C，优选25-27°C，最优选25°C，进行二级种子培养；将二级种子罐内发酵种子液接种三级发酵罐内进行发酵培养，接种量优选7%-13%，最优选10%，过程中连续通加无菌空气，通气量O. 4-1. Ovvm,通气量O. 4-1. Ovvm,优选O. 5-0. 8vvm,最优选O. 7vvm,搅拌速度100-200rpm，优选120_180rpm，最优选150rpm，控制培养温度在24-28 °C，优选25-27 0C，最优选26 °C，进行发酵培养；其中步骤b)和c)中所采用的培养基均为如第一方面所述的培养基。本发明的有益效果( I)本发明通过发酵培养基组成设计，采用营养成分组合来高效控制发酵过程pH波动，使PH控制在恒定且适宜范围内，减少或减除了通过外部设备补充酸碱来调节发酵PH的操作步骤，以及由此带来的染菌隐患，大大提高发酵过程可控性和稳定性；(2)本发明的方法采用的铵盐可以作为氮源替代部分酵母膏，实现高价氮源的减量，可大大降低培养基成本。
图I是本发明的培养方法的流程示意图。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。实施例I采用本发明的培养基(具体成分见表1)，按照下列步骤进行藻种的500L、6立方、60立方三级放大培养,藻种属于海洋破囊壶菌(Thraustochytrids)类首先，对藻种进行活化，采用斜面或平板划线，于25°C恒温培养3-5天，挑取形态饱满、生长旺盛的藻落，再次进行斜面或平板划线，于25°C恒温培养3-5天后作为摇瓶预培养藻种，保存方法采用低温冷冻。其次，摇瓶预培养，挑取藻落接种于含有无菌的上述培养基的洁净摇瓶中，25°C， 150-300rpm下振荡培养，此步骤可包括2_3级体积放大预培养，完成种子预培养后，将摇瓶种子合并至无菌容器内，此步骤为种子预培养阶段。再次是发酵放大培养，包括一级、二级与三级放大发酵培养，将摇瓶种子接种采用火焰或压差接种法接入一级种子罐，接种量2%-10%，通入无菌空气并搅拌，通气量
O.4-1. Ovvm, 100-300rpm,控制培养温度在24-28 °C，最优25 °C，进行一级种子培养。一级种子培养至一定阶段后将一级种子罐内发酵种子液采用压差法接种至含有上述无菌培养基的二级种子罐，接种量5%-15%，二级种子罐完成接种后，通入无菌空气并搅拌,通气量O. 4-1. Ovvm, 100-300rpm，控制培养温度在24-28°C，最优25°C，进行二级种子培养。二级种子培养至一定阶段后将二级种子罐内发酵种子液采用压差法接种至含有上述无菌培养基的三级发酵罐内进行发酵培养，接种量5-15%，过程中连续通加无菌空气，通气量
O.4-1. Ovvm, 100-200rpm,控制培养温度在24_28°C，最优25°C，进行发酵培养。最后，当细胞干重增加至平台期或细胞不适宜继续培养等情况出现时，停止发酵培养，放罐，将发酵液储存于储藏罐内，通入离心机进行发酵液浓缩收集，获得浓缩液后，通入喷雾干燥塔内获得产品。二者在细胞代谢过程中被消耗，对发酵pH产生升高和降低的影响，作用相互抵消，实现发酵过程PH的稳定和高效控制。表I:培养基组成
组分含量(g/L) 组分含量(ppm)
葡萄糖30维生素BI30
酵母膏15B65
谷氨酸纳 B12
硫酸铵维生素H I
氯化纳12^rBA权利要求
1.一种培养基，所述培养基中包含强酸弱碱盐与弱酸强碱盐的组合，其中，所述强酸弱碱盐为有机及无机强酸铵盐，优选地为硝酸铵、硫酸铵，氯化铵、草酸铵或其中至少两种的混合物，更优选地为硫酸铵，所述弱酸强碱盐为碳酸或氨基酸的钠盐、钾盐或钙盐或其中至少两种的混合物。
2.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于，所述强酸弱碱盐与弱酸强碱盐的组合将所述培养基的PH控制为4. 0-9. 0，优选地5. 0-8. O，最优选地6. 0-7. O。
3.根据权利要求I或2所述的培养基，其特征在于，所述氨基酸的钠盐、钾盐或钙盐为谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸的钠盐、钾盐或钙盐或者其至少2种的混合物。
4.根据权利要求I或2所述的培养基，其特征在于，所述弱酸强碱盐为谷氨酸钠。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中谷氨酸钠的含量为l-20g/L，优选为5-15g/L，更优选为8-12g/L，最优选为10g/L。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的培养基，其特征在于，硫酸铵的含量为O.5-5g/L，优选为l_4g/L，更优选为2-3. 5g/L，最优选为3g/L。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包含其他氮源、碳源、无机盐和微量元素； 优选的，所述碳源为废糖蜜、甘蔗汁、玉米粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、二氧化碳或其至少2种的混合物； 优选的，所述氮源为有机氮化合物、无机氮化合物或其混合物； 优选的，所述无机盐包括钠盐、镁盐、钾盐、铁盐、钙盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐或其至少2种的混合物；和/或， 优选的，所述微量元素包括维生素BI、维生素B6、维生素B12、维生素H、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)或其至少2种的混合物。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述有机氮化合物包括酵母提取物、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、氨基酸、谷氨酸钠或其至少2种的混合物；和/或， 所述无机氮化合物包括尿素、亚硝酸盐、硝酸盐、无机铵盐或其至少2种的混合物。
9.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于所述培养基包含葡萄糖10-200g/L，谷氨酸钠l_20g/L，硫酸铵O. 5-5g/L，酵母膏浓度为碳源浓度的1/2-1/10，所述无机盐，以钠盐为标准，O. l_35g/L，所述微量元素中维生素BI浓度10-30ppm，维生素B6浓度5_15ppm，维生素B12浓度l_5ppm,维生素H浓度l_5ppm, 6-BA浓度3_15ppm。
10.一种微生物的培养方法，其特征在于，所述方法包括在发酵过程中采用如权利要求1-9中任一项所述的培养基。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述微生物为微藻。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述方法包括在摇瓶预培养、一级种子培养、二级种子培养和/或三级发酵培养中采用如权利要求1-9中任一项所述的培养基。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法包括 a)活化培养，将藻种采用斜面或平板划线，于25°C恒温培养3-5天，挑取形态饱满、生长旺盛的藻落，再次进行斜面或平板划线，于25°C恒温培养3-5天；b)摇瓶预培养，挑取活化的藻落接种于洁净摇瓶中，25°C，150-300rpm,优选150-250rpm,最优选200rpm下振荡培养； c)发酵放大培养，其中将摇瓶预培养获得的藻种接入一级种子罐，接种量2%-10%，优选4%-8%，最优选6%，通入无菌空气并搅拌，通气量O. 4-1. Ovvm,优选O. 5-0. 8vvm,最优选O. 7vvm,搅拌速度100-300rpm，优选150_250rpm，最优选200rpm，控制培养温度在24_28°C，优选25-27°C，最优选26°C，进行一级种子培养；将一级种子罐内发酵种子液接种至二级种子罐，接种量5%-15%，优选7%-13%，最优选10%，通入无菌空气并搅拌，通气量O. 4-1. Ovvm,优选 O. 5-0. 8vvm,最优选 O. 7vvm,搅拌速度 100-300rpm,优选 150-250rpm,最优选 200rpm,控制培养温度在24-28°C，优选25-27°C，最优选25°C，进行二级种子培养；将二级种子罐内发酵种子液接种三级发酵罐内进行发酵培养，接种量优选7%-13%，最优选10%，过程中连续通加无菌空气，通气量O. 4-1. Ovvm,通气量O. 4-1. Ovvm,优选O. 5-0. 8vvm,最优选O. 7vvm,搅拌速度100-200rpm，优选120_180rpm，最优选150rpm，控制培养温度在24-28 °C，优选25-27 0C，最优选26 °C，进行发酵培养； 其中步骤b)和c)中所采用的培养基均为如权利要求1-9中任一项所述的培养基。·
全文摘要
本发明公开了一种微生物培养基及培养方法。所述培养基包含强酸弱碱盐与弱酸强碱盐的组合，从而使其自身具有了一定的pH调控能力，可以在培养过程中将pH控制在恒定且适宜范围内，减少或减除了通过外部设备补充酸碱来调节发酵pH的操作步骤，以及由此带来的染菌隐患，大大提高发酵过程可控性和稳定性；同时作为强酸弱碱盐的铵盐可以作为氮源替代部分酵母膏，实现高价氮源的减量，可大大降低培养基成本。
文档编号C12N1/12GK102911868SQ20121036978
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者刘敏胜, 冯倩, 蔡忠贞, 王琳 申请人:新奥科技发展有限公司