专利名称：一种hTERTmRNA的TRPCR检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种端粒酶催化亚基(hTERT)mRNA的预备模板PCR (Template-ReadyPCR, TRPCR)检测试剂盒及检测方法。
(ニ)
背景技术：
端粒酶(telomerase)是ー种特殊的逆转录酶,是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白(RNP)复合物，包含3个主要成分端粒酶RNA (hTR)模板，端粒酶催化亚单位(hTERT)和端粒酶相关蛋白(hTLP)。hTR是端粒酶进行延伸反应的模板，约有450个碱基，其中包 含5’ -CUAACCCUAAC-3’的模板序列；hTERT是端粒酶逆转录酶的蛋白催化亚基，hTLP是端粒酶的调节单位。端粒酶的主要功能是利用染色体末端(端粒)的3’末端为引物，以自身RNA为模板合成端粒-TTAGGG-重复序列添加到染色体末端，从而维持端粒原有长度，使端粒的稳定和保护染色体的功能得以延续，细胞因逃逸渐进性衰老而达到“永生化”。在ー些特定的组织细胞，如生殖细胞、胚胎细胞、造血干细胞、外周血淋巴细胞、毛发、皮肤、子宮内膜等分裂旺盛的组织细胞中有低水平的活化端粒酶的表达，但在正常成熟的体细胞中则没有端粒酶活性，这些体细胞因为端粒的逐渐缩短而导致衰老和死亡。极少数体细胞可能偶然通过激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤性发展，即癌变，因此，端粒酶的重新激活是体细胞向肿瘤细胞转化，即癌变的关键步骤。对大量的临床标本的检测表明，绝大多数的肿瘤细胞都呈端粒酶阳性(>85%)，而在癌旁组织和正常组织的端粒酶阳性率很低(<5%)，因此，端粒酶是ー个被广泛接受的特异性很高的肿瘤标志物。细胞内端粒酶的调控主要是通过hTERT的表达调控来实现的，hTERT mRNA的表达水平在癌细胞中有明显上调，因此，对hTERT mRNA的检测可能发展成为对癌症进行检测和分子诊断的有力手段。RT-PCR (reverse transcription 逆转录-聚合酶链反应)，指将逆转录(ReverseTranscription, RT)反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。RT- PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了ー种分析基因表达的快速灵敏的方法。然而，RT-PCR在临床检测应用方面，存在很大的改进空间，主要问题是(1)依赖于逆转录反应，且2步酶促反应(逆转录和PCR)的最优反应条件是有差异的，体系优化受到限制；(2)需要严格预防和抑制RNA酶的污染，需要提取纯化RNA，前处理的过程复杂，操作要求高，步骤繁琐，耗时长；(3)容易受到各种抑制物质的影响，容易受到假阳性的困扰；(4)逆转录酶的价格居高不下，操作成本很难降下来；(5)对于低丰度RNA的检测灵敏度不够高的时候，需要采用非常复杂和容易污染的套式PCR。
发明内容
本发明目的是提供ー种操作简单快速、特异性强的用于端粒酶催化亚基(hTERT)检测的试剂盒及检测方法。本发明采用的技术方案是
ー种端粒酶催化亚基(hTERT) mRNA的预备模板PCR检测试剂盒，主要包括(I)管内固定有探针A的锚定PCR管；所述探针A核苷酸序列如下5’ -GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3，；探针A是与目标RNA上一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，这段序列位于下面所述的探针B互补结合的区域之外；探针A的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于锚定探针A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；(2)探针 B，其核苷酸序列如下5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGITTCGGCG-3’ ；探针 B 是包含与目标 RNA 上另一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为两端是特异的PCR引物序列，中间为与目标RNA序列的互补序列；(3) PCR 引物NTPl :5，- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3，NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，；(4)裂解液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂(如吐温20、NP-40等)、用于细胞裂解的缓冲液；
(5) PCR缓冲液；所述缓冲液为PCR反应常规缓冲液；(6)洗涤液；所述洗涤液可为本领域常规含有表面活性剂(如吐温20、NP_40等)的缓冲液。该试剂盒的原理如下(1)预先制备好与目标RNA上一段序列互补的锚定探针——探针A ;探针A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附结合核酸的固体介质上，作用是通过特异性地结合目标RNA,将目标RNA选择性地吸附在固体介质上；(2)与目标RNA上另一段序列互补的模板探针——探针B ;探针B两端带有PCR引物序列，使用时是添加在裂解液中的；当细胞被裂解后，探针B通过部分杂交与目标RNA结合，这样探针B也就被选择性地吸附在上述固体介质上；(3)在杂交反应之后，经过反复清洗，只有能与探针A互补杂交结合的目标RNA分子及与该RNA杂交结合的探针B留在反应管中；(4)由于探针B两端带有PCR引物序列，这样加入PCR反应液后，以探针B为模板，不需要RT，可直接进行PCR反应。优选的，所述裂解液组成如下l%(w/vol)SDS, 500mmol/L NaCl, 2mmol//L MgCl2,10mmol/L 2-疏基こ醇，0. lmg/ml 鱼精 DNA (市购)，0.1% (vol/vol) Tween20,1% (w/vol)脱脂奶粉，溶剂为10mmol/L、pH7· 5的Tris_HCl。优选的，所述PCR 缓冲液组成如下50mmol/L KCl, I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/LdNTP，5% (vol/vol)DMS0,0. 05%(vol/vol) Tween20,0. 4XSYBR Green I(浓度 0.4X 的含义是，其中各组分在反应液中的终浓度为IXSYBR Green I中的0. 4倍，市购Miroprobe原液浓度为10000X，使用时按体积比稀释至PCR缓冲液中终浓度为0. 4X即可)，0. 5U/20ulTaq 酶，溶剂为 10mmol/L、ρΗ9· O 的 Tris-HCl。优选的，所述洗涤液为TBST缓冲液，其终浓度组成为150 mmol/L NaCl, 0. 05%Tween 20，溶剂为 10 mmol/L、pH 7.5Tris_HCl。本发明还涉及利用所述试剂盒检测端粒酶催化亚基mRNA的方法，所述方法包括
(I)取待测样本，加入探针B和裂解液(裂解液中探针B添加浓度为O. Inmol/L 100nmOl/L)，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4°C离心，取上清液，得到裂解上清液；待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下I飞ml痰液+ 5^10 ml痰融液,37°C振荡IOmin, 4°C、5000 rpm离心IOmin,弃上清,取沉淀+ 200 ul裂解液(其中探针8浓度为1鹽01/1)，反复吸打，转移到1.5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成PBS+0. 1% (w/vol) DTT0待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下24孔板细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解液(其中探针B浓度为lnmol/L)，反复吸打，转移到1.5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液； 1.5 ml离心管中，+ 200ul裂解液(其中探针B浓度为lnmol/L)，用吸头捣碎组织，室温振荡IOmin,4°C>15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；(2)取步骤(I)裂解上清液20uL至锚定PCR管中，6(T70°C保温进行杂交反应5 15min，反应结束后吸干管内液体，以洗涤液洗涤T9次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物(PCR反应液中引物对浓度为0. 2umol/L)配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；在杂交反应之后，通过多次反复的洗涤，在洗去未杂交结合的核酸的同时，也洗去了其他可能干扰PCR反应的物质，从而保证了 PCR反应的特异性和成功率;(3)以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤(I)和(2)方法进行处理和分析，以空白裂解液Ct值减去样本Ct值的差值大于或等于1，判断样品为阳性。所述PCR扩增条件如下93°C预变性3min ;然后93°C 3s、66°C 30s, 35个循环。本发明采用最新的预备模板PCR (Template-Ready PCR，TRPCR)技术，整个PCR的前处理流程被简化成裂解保温洗涤等3步简单操作，耗时由常规的4个小时以上，減少到50分钟以下，不需要纯化RNA，不需要去除DNA，不需要对RNA进行特别的保护，不需要进行逆转录反应，因此，操作简单，快速，标准化程度高。由于RNA的利用率高，引物是特别优化设计，且通过洗涤步骤能去除各种干扰因素，PCR的特异扩增效率得到了很大的增强。
图I为本发明原理示意图；A:探针A;B:探针B;C:固定介质；P1/P2:引物对；RNA:目标RNA; IIII:双链互补杂交结合。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :洗涤去除非固定的探针B用于检测hTERT mRNA 的探针 B : 5’ -CAGGAGCAGCATTCCATCACGCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’，阴影部分为与 mRNA 结合的互补序列，两端为 PCR 引物序列。PCR 引物TABl CAGGAGCAGCATTCCATCACG, TAB2 CCTTCTCTGGACCTGCGACG。肺癌细胞株A549细胞于24孔板中进行细胞培养，1000个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+ 200ul裂解液B (裂解液添加探针B浓度为lnmol/L)，反复吸打，转移到I. 5ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到细胞裂解上清液；裂解液B组成如下1%SDS,500mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2,10mmol/L 2-巯基こ醇，O. lmg/ml 鱼精 DNA (Sigma 公司)，O. 1% Tween20,1% 脱脂奶粉，lnmol/L 探针 B，溶剂为10mmol/L、pH7.5 的 Tris-HCl ；取50ul的上述的细胞裂解液上清，其中含有lnmol/L的探针B，加到0. 2ml的PCR薄壁管中，66°C保温lOmin，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1，3，5，7，9或12次，加入50ul PCR反应液(50ul PCR缓冲液+引物对0. 2umol/L)，进行PCR程序(94°C 3min预变性，然后40个循环的94°C 3s,66°C 30s，ニ步法)，以SYBR green I荧光定量分祈，结果显示洗涤次数达到及超过5次，探针B不再有强于空白対照的扩增信号(Ct值与空白相当)，表明洗涤步骤可以彻底洗掉不结合的探针DNA。
洗涤次数Ct-空白対照Ct-探针B
I29.1115.15
328.2421.33
528.5427.25
728.7328.31
929.3128.63
1228.7128.32空白対照的Ct值(来源于引物ニ聚体)在28. 2Γ29. 31之间。当洗涤次数达到及超过5次，探针B的Ct值为27. 25 28. 63，与空白対照的值相当，说明不再有特异扩增。TBST 缓冲液组成150 mmol/L NaCl, 0. 05% Tween 20，溶剂为 10 mmol/L、pH7.5Tris-HCl ；PCR 反应液(SYBR 荧光定量)组成50mmol/L KC1，I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/LdNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4X SYBR Green 1,0. 5U/20ul Taq酶，0. 2umol/L引物对，溶剂为 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。实施例2 :磁珠法制作锚定管用于锚定hTERT mRNA 的探针 A : 5，- GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA。TBST缓冲液20ul，含有IOug Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠和2pmol生物素化的探针A (生物素化的探针A由合成时直接修饰加在5’端)，装入O. 2ml的PCR薄壁管中，室温lhr，以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加50ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共6次，最后吸干；加50ul TE缓冲液，备用。细胞裂解24孔板细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解液B (同实施例I )，反复吸打，转移到I. 5 ml离心管中，冰上20min, 4°C> 15000 rpm离心20min,取上清,得到细胞裂解上清。然后以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加入20ul细胞裂解上清，其中含有探针B，66°C保温5min，再以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤6次，加入20ul PCR反应液(SYBR荧光定量)，进行PCR程序(95°C 2min预变性，然后40个循环的95°C 3s,66°C 30s, ニ步法)，SYBR荧光定量分析。用这种方法，对1(Γ10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果(细胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值)。
权利要求
1.ー种端粒酶催化亚基(hTERT) mRNA的预备模板PCR检测试剂盒，主要包括 (1)管内固定有探针A的锚定PCR管；所述探针A核苷酸序列如下5’-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3’ ； (2)探针B，其核苷酸序列如下5，-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3，； (3)PCR 引物NTPl :5，- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3，NTP2 :5， - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，； (4)裂解液; (5)PCR缓冲液； (6)洗涤液。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述裂解液组成如下1%SDS,500mmol/LNaCl, 2mmol/L MgCl2,1Ommol/L 2-疏基乙醇,O. lmg/ml 鱼精 DNA, 0.1% Tween20,1% 脱脂奶粉，溶剂为 10mmol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。
3.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液组成如下50mmol/LKCl,I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4XSYBR Green I,0.5U/20ul Taq 酶，溶剂为 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为TBST缓冲液。
5.利用如权利要求I所述试剂盒检测端粒酶催化亚基mRNA的方法，所述方法包括 (1)取待测样本，加入探针B和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4°C离心，取上清液，得到裂解上清液； (2)取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，6(T70°C保温5 15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3、次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析； (3)以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤(I)和(2)方法进行处理和分析，以空白裂解液Ct值减去样本Ct值的差值大于或等于1，判断样品为阳性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下93°C预变性3min；然后93°C 38、66で308，35个循环。
全文摘要
本发明提供了一种端粒酶催化亚基(hTERT)mRNA的检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒主要包括(1)管内固定有探针A(SEQ ID No.1)的锚定PCR管；(2)探针B(SEQ ID No.2)；(3)PCR引物(SEQ ID No.3/4)；(4)裂解液；(5)PCR缓冲液；(6)洗涤液。本发明与采用传统的RT-PCR方法的试剂盒相比，采用本试剂盒不需要纯化抽提RNA，不需要进行逆转录反应，将原本长达3个小时以上的PCR前处理过程缩短为约50分钟，因此，操作简便快速易行，具有较高的RNA检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的细胞， 包括从组织，痰液，血液等标本中收集的细胞进行hTERT mRNA的检测。
文档编号C12Q1/68GK102851387SQ20121036976
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者陈燃, 伍迪, 金晓铮 申请人:浙江今复康生物科技有限公司