专利名称：固相-数字pcr芯片及其制作方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片研究领域，特别涉及一种固相-数字PCR芯片及其制作方法。
背景技术：
在进行生物研究和实际检测时，有时待测DNA样品的量较少或者从样品中提取的待测DNA分子浓度较低时，为了得到较好的结果，通常需要先对样品分子的量进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。虽然常规的PCR技术已广泛应用于生命科学研究及相关领域，并且在应用过程中不断得到改进，但目前仍然存在着耗时太长，操作繁琐，试剂消耗量大，扩增结果不稳定等缺点。因此人们一直在寻求更快速更简便的PCR方法。固相PCR是将特定的引物寡核苷酸通过不同的方法固定在固相支持物上来扩增目的DNA。固相支持物有琼脂糖小珠，聚丙烯酰胺小珠，乳胶小珠，磁珠，普通玻片以及硅片 等。固相PCR可以将核酸扩增、核酸分离和核酸检测三个相互独立的步骤整合在一起，避免常规PCR扩增的一些干扰因素，PCR反应产物易于分离纯化，同时可实现多个不同扩增反应的同步进行。固相PCR在快速基因分型、药学基因组学以及基于基因组学的药物发展中有广泛的用途。数字PCR是最新的DNA定量技术，其基于单分子PCR并采用计数的方法对DNA进行定量，因此是一种绝对定量的工具。将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微量反应体系中，每个反应体系的DNA模板数少于I个。在PCR循环反应之后，可根据发出荧光信号的微量反应体系所占有的比例来判定原始DNA浓度。固相-数字PCR两者的结合，利用了数字PCR的特点实现了在微量体系中低浓度待测DNA的定量检测，同时亦可通过固相PCR将待测DNA片段多重拷贝固定在盖片表面，可用于后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种固相-数字PCR芯片及其制作方法，其制作简单，易操作，成本低廉。并且综合了固相PCR高通量、低干扰的优势同时兼具数字PCR低浓度定量检测的特点，为低浓度、稀有样品DNA定量检测及其后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析等提供良好的操作平台。本发明提供一种固相-数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤步骤I :取一基片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；步骤2 :在基片正面生长牺牲层；步骤3 :通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模图形转移到牺牲层上；步骤4 :以牺牲层为掩膜，通过刻蚀工艺，在基片上形成微孔阵列；步骤5 :取一盖片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；步骤6 :在盖片正面旋涂PDMS膜，并加热使PDMS膜固化；
步骤7 :对PDMS膜进行表面处理，并将DNA探针结合在PDMS膜的表面；步骤8 :将基片与盖片键合，使基片上微孔阵列中的每个微孔形成独立反应池，形成固相-数字PCR芯片。本发明还提供一种固相-数字PCR芯片，包括一基片；一微孔阵列，该微孔阵列通过光刻工艺和两步刻蚀工艺制作在基片上；一盖片；一 PDMS膜，该PDMS膜通过旋涂、加热固化在盖片表面；
该基片，微孔阵列，盖片与PDMS膜形成了固相-数字PCR芯片。
为了进一步说明本发明的内容和特点，以下结合附图及实施例对本发明做一详细描述，其中图I为本发明流程图；图2为固相-数字PCR芯片制作的步骤示意图。
具体实施例方式请参阅图I结合参阅图2所示，本发明为一种固相-数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤步骤I :取一基片10，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥，所述基片10材料为硅片、石英片、光纤面板或有机薄片，清洗是依次使用超声波在分析纯三氯乙烯、丙酮、无水乙醇、去离子水中清洗，去除基片10表面的有机杂质，随后使用氨水和双氧水的混合液，盐酸和双氧水的混合液，硫酸和双氧水的混合液加热煮沸基片10,并使用去离子水冲洗，去除基片10表面的无机杂质，此种清洗方式可除去基片10表面的有机附着物和无机颗粒物，将清洗后的基片10用氮气吹干后装入培养皿中，之后放入真空干燥箱内前烘，前烘的温度一般高于100摄氏度，前烘操作目的是去除基片10本身附带的水蒸气；步骤2 :在基片10正面生长牺牲层，所述牺牲层材料和生长厚度依据后续刻蚀工艺以及刻蚀的深度而定；步骤3 :通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上的图形转移到牺牲层上；所述光刻工艺包括匀胶、前烘、曝光、显影等步骤，刻蚀工艺包括干法刻蚀和湿法刻蚀两种；步骤4 :以牺牲层为掩膜，通过刻蚀工艺，在基片10上形成微孔阵列11 ;根据需要选择物理干法刻蚀或化学湿法腐蚀的方式来制作微孔阵列11，其作用机理是利用气体等离子或化学试剂对基片10的腐蚀作用，在基片10无牺牲层覆盖区域形成微孔阵列11。微孔阵列11中的每个微孔形成一个皮升到纳升量级的独立反应池，用于数字化PCR反应，微孔阵列11以矩形、环形、镜像或密排等形式阵列排布，微孔阵列11数目大于5000，其深度大于5微米，微孔阵列11中的微孔形状为正多边形或圆形，正多边形或圆形大小取决于后续生物反应所需要的体量，正多边形的外接圆的直径或圆形的直径大于5微米，微孔阵列11中的各个微孔之间通过孔壁的隔离形成的独立反应池。孔壁的厚度取决于后续生物反应的检测方式，孔壁厚度大于2微米。
步骤5 :另取一盖片12，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；所述盖片材料为为石英片或硅片，清洗是依次使用超声波在分析纯三氯乙烯、丙酮、无水乙醇、去离子水中清洗，去除盖片12表面的有机杂质，随后使用氨水和双氧水的混合液，盐酸和双氧水的混合液，硫酸和双氧水的混合液加热煮沸盖片12，并使用去离子水冲洗，去除盖片12表面的无机杂质，此种清洗方式可除去盖片12表面的有机附着物和无机颗粒物，将清洗后的盖片12用氮气吹干后装入培养皿中，之后放入真空干燥箱内前烘，前烘的温度一般高于100摄氏度，前烘操作目的是去除盖片12本身附带的水蒸气；步骤6 :在盖片12正面旋涂PDMS膜13，并加热使PDMS膜13固化；盖片12上旋涂的PDMS膜13的厚度为5微米到500微米，可通过调整匀胶机的转速和匀胶时间来对PDMS膜13的厚度进行调整，旋涂结束后将覆盖有PDMS膜13的盖片12放入真空烘箱中烘烤，力口速PDMS膜13的固化；步骤7 :对PDMS膜13进行表面处理，并将探针结合在PDMS膜13表面；用氧等离子体或是表面活性剂处理活化PDMS膜13的表面，使之可高密度结合DNA探针；
步骤8 :将步骤1、2、3、4得到的基片与步骤5、6、7得到的盖片紧密贴合，使基片10上微孔阵列11中的每个微孔形成独立反应池，形成固相-数字PCR芯片；所述步骤1、2、3、4、5、6、7、8制备的固相-数字PCR芯片可在微孔阵列11中实现体量为皮升到纳升量级的高通量数字PCR，同时可通过盖片表面的探针有效的回收数字PCR产物，在同一芯片上实现两种功能。并为后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析提供了操作平台。请在参阅图2,并结合参阅图I所示,本发明为一种固相-数字PCR芯片,包括—基片10 ;基片10材料为娃片、石英片、光纤面板或有机薄片；一微孔阵列11，该微孔阵列11通过光刻工艺和两步刻蚀工艺制作在基片10上，微孔阵列11以矩形、环形、镜像或密排等形式阵列排布，微孔阵列11数目大于5000，其深度大于5微米，微孔阵列11中的微孔形状为正多边形或圆形，正多边形或圆形大小取决于后续生物反应所需要的体量，正多边形的外接圆的直径或圆形的直径大于5微米，微孔阵列11中的各个微孔之间通过孔壁的隔离形成的独立反应池。孔壁的厚度取决于后续生物反应的检测方式，孔壁厚度大于2微米；一盖片12 ;盖片12材料为石英片或硅片；一 PDMS膜13，该PDMS膜13通过旋涂、加热固化在盖片12表面；盖片12上旋涂的PDMS膜13的厚度为5微米到500微米，该基片10，微孔阵列11，盖片12与PDMS膜13形成了固相-数字PCR芯片。综上所述，固相-数字PCR芯片及其制作方法至少有以下优点I.本发明固相-数字PCR芯片提出了一种结合固相PCR及数字PCR的双层芯片结构。2.本发明固相-数字PCR芯片制作工艺简单，操作简便，同时兼具可靠性高、成本低廉等特点。3.本发明固相-数字PCR芯片微孔深度、孔径大小、孔壁厚度均有很大的调节范围，适合多种应用需求。4.本发明固相-数字PCR芯片综合了固相PCR高通量、低干扰、易纯化的优势同时兼具数字PCR低浓度定量检测的特点，适用于低浓度、稀有样品DNA定量检测。5.本发明固相-数字PCR芯片可逆键和为后续使用盖片固相PCR产物做全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析等提供良好的操作平台。
以上所述，仅是本发明的实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案范围内，因此本发明的保护范围当以权利要求书为准。
权利要求
1.一种固相-数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤 步骤I:取一基片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥； 步骤2 :在基片正面生长牺牲层； 步骤3 :通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模图形转移到牺牲层上； 步骤4 :以牺牲层为掩膜，通过刻蚀工艺，在基片上形成微孔阵列； 步骤5 :取一盖片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥； 步骤6 :在盖片正面旋涂PDMS膜，并加热使PDMS膜固化； 步骤7 :对PDMS膜进行表面处理，并将DNA探针结合在PDMS膜的表面； 步骤8 :将基片与盖片键合，使基片上微孔阵列中的每个微孔形成独立反应池，形成固相-数字PCR芯片。
2.如权利要求I所述的固相-数字PCR芯片的制作方法，其中所述基片上微孔阵列以矩形、环形、镜像或密排的形式排布，且微孔数目大于5000，其微孔深度大于5微米。
3.如权利要求2所述的固相-数字PCR芯片的制作方法，其中所述基片上微孔阵列中的微孔形状为正多边形或圆形，正多边形的外接圆的直径或圆形的直径大于5微米，微孔的孔壁厚度大于2微米。
4.如权利要求I所述的固相-数字PCR芯片的制作方法，其中所述基片的材料为硅片、石英片、光纤面板或有机薄片。
5.如权利要求I所述的固相-数字PCR芯片的制作方法，其中所述盖片上旋涂的PDMS膜的厚度为5微米到500微米。
6.如权利要求5所述的固相-数字PCR芯片的制作方法，其中所述盖片上PDMS膜表面处理方式为氧等离子体处理或表面活性剂处理。
7.如权利要求6所述的固相-数字PCR芯片的制作方法，其中所述盖片的材料为石英片或硅片。
8.一种固相-数字PCR芯片，包括 一基片; 一微孔阵列，该微孔阵列通过光刻工艺和两步刻蚀工艺制作在基片上； 一盖片; 一 PDMS膜，该PDMS膜通过旋涂、加热固化在盖片表面； 该基片，微孔阵列，盖片与PDMS膜形成了固相-数字PCR芯片。
9.如权利要求8所述的固相-数字PCR芯片，其中所述基片的材料为硅片、石英片、光纤面板或有机薄片。
10.如权利要求8所述的固相-数字PCR芯片，其中所述盖片的材料为石英片或硅片。
11.如权利要求10所述的固相-数字PCR芯片，其中所述盖片上旋涂的PDMS膜的厚度为5微米到500微米。
12.如权利要求8所述的固相-数字PCR芯片，其中所述基片上微孔阵列以矩形、环形、镜像或密排的形式排布，且微孔数目大于5000，其微孔深度大于5微米。
13.如权利要求12所述的固相-数字PCR芯片，其中所述基片上微孔阵列中的微孔形状为正多边形或圆形，正多边形的外接圆的直径或圆形的直径大于5微米，微孔的孔壁厚度大于2微米。
全文摘要
一种固相-数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤步骤1取一基片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；步骤2在基片正面生长牺牲层；步骤3通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模图形转移到牺牲层上；步骤4以牺牲层为掩膜，通过刻蚀工艺，在基片上形成微孔阵列；步骤5取一盖片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；步骤6在盖片正面旋涂PDMS膜，并加热使PDMS膜固化；步骤7对PDMS膜进行表面处理，并将DNA探针结合在PDMS膜的表面；步骤8将基片与盖片键合，使基片上微孔阵列中的每个微孔形成独立反应池，形成固相-数字PCR芯片。本发明具有制作简单，易操作，成本低廉的优点。
文档编号C12M1/34GK102899244SQ201210369310
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者韩伟静, 魏清泉, 孙英男, 李运涛, 俞育德, 周晓光 申请人:中国科学院半导体研究所