一种产木聚糖酶微生物甄别培养基及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体地涉及一种产木聚糖酶微生物甄别培养基及其培养方法。
【背景技术】
[0002]传统筛选木聚糖酶产酶活性菌株的方法是，先从自然界分离培养微生物，再采用随机获取的纯培养微生物作为出发菌株，在含有木聚糖底物的琼脂平板上接种，并配加一定浓度的色素指示物，通过色素，产酶的活性菌株则会产生相应的透明圈，从而将产酶活性菌株甄别、筛选出来，此法一般称为透明圈法。
[0003]此弊病主要有二种。第一，不利于野外作业。野外采集、收集的土壤或其它样品必须带回实验室进行分离培养，获得单菌落纯培养物后，再通过透明圈法筛选木聚糖酶活性菌株。在采集与分离这个时间段内，样品的微生物群落已经发生了极大的变化，绝大多数生长势较弱的稀有微生物已经被优势微生物群体“埋没”。第二，筛选方法过于精细，使整个筛选过程实验工作量过大，导致劳动负荷较大，最终导致效率较低。一般筛选木聚糖酶产酶活性菌株的过程分为初筛、第一次复筛、第二次复筛……第η次复筛，等等。采用透明圈法应用于初筛、第一次复筛尤其显得过于精细，导致整个过程工作量过大。另外，在木聚糖酶相关利用工厂内，菌株的保藏一般采用常规的菌株保藏的方法，这样，非常容易导致菌株的酶活性退化。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种微生物甄别培养基以及使用所述微生物甄别培养基来简易快速地培养微生物，本发明更进一步的目的是提供一种筛选木聚糖酶活性目标菌株的方法。该新型的微生物甄别培养基能够在野外很方便地临时制备，保持培养基的新鲜度从而适用于采集样本后立刻进行菌株分离培养，并且能够高效率筛选目标活性菌株。
[0005]在本发明的一个方面，提供了一种微生物甄别培养基，包括胡萝卜、西红柿汁以及底物。
[0006]优选的，所述胡萝卜切成片并刻划连续凹槽；
[0007]优选的，所述凹槽为“Ζ”字型、“S”型、“螺旋”型。
[0008]优选的，所述的凹槽的形状如图1所示，凹槽的长度D2小于胡萝卜片的直径D1，胡萝卜片的直径Dl为50-70mm，胡萝卜片的厚度D3为6-10mmo
[0009]优选的，所述底物为用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别配制的燕麦木聚糖、桦木木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖xylo-oligo 95P等比混合溶液。
[0010]本发明的所述微生物甄别培养基按照如下的方法来制备:
[0011](I)将市售胡萝卜切成片；
[0012](2)在所述的胡萝卜片上刻划连续凹槽，
[0013](3)在所述的胡萝卜片凹槽中倾倒经过无菌过滤器除菌的营养液；
[0014]优选的，所述的凹槽不超过胡萝卜片的边缘，优选的，凹槽的深度为I?5mm，宽度为 0.5 ?5mm ；
[0015]进一步优选地，所述的凹槽的深度为3mm，宽度为Imm ;优选的营养液的深度为I?2mm ο
[0016]其中，所述营养液为所述西红柿汁和所述底物混合而成，所述西红柿汁和所述底物的体积比为300:1。
[0017]其中，将西红柿经匀浆器研磨至无颗粒状碎片，过滤取滤液，所述滤液灭菌后即得所述西红柿汁。
[0018]优选的，在过滤时，选用20目筛过滤；且筛孔上覆盖I?2层卫生纸；
[0019]优选的，所述灭菌方法为巴氏灭菌法；
[0020]优选的，所述底物中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH为5.8 ;
[0021]优选的，所述燕麦木聚糖、桦木木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖xylo-oligo95P的浓度均为0.6mg/ml ；
[0022]在本发明的一个方面，营养液经过实验室泡制后可以以密封容器罐装从而方便携带，只在分离微生物时再进行分装，从而有利于野外现场作业。
[0023]在本发明的另一个方面，提供了一种培养微生物的方法，所述的方法包括步骤:
[0024](I)取市售胡萝卜切成片，在所述胡萝卜片上刻划连续凹槽；
[0025](2)取样品液与西红柿汁以及底物混合，滴于上述胡萝卜片的凹槽中，使其均匀分布于所述微生物甄别培养基的凹槽中；
[0026](3)在室温下静置培养2-4天；
[0027](4)取得在胡萝卜片上的微生物。
[0028]优选的，步骤(I)中的胡萝卜预先放置在培养皿中；
[0029]优选的，所述培养皿中预先铺有无菌滤纸或无菌纱布，所述无菌滤纸或无菌纱布含有无菌水。
[0030]优选的，步骤(2)所述样品液为:样品(土壤等固体物质需要先研磨，再用等体积无菌水萃取)适量，添加适量无菌玻璃珠，手动振荡5分钟后静置澄清I分钟，取上清液成为样品液。
[0031]优选的，步骤⑵中混合的过程包含:取西红柿汁、样品液、底物，三者的体积比为300:100:1。其中，将西红柿经匀浆器研磨至无颗粒状碎片，过滤取滤液，所述滤液经灭菌后即得所述西红柿汁；所述底物为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别配制的燕麦木聚糖、桦木木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖xylo-oligo 95P的等比混合溶液。
[0032]优选地，所述样品为土壤时，选取腐殖质含量较低的土壤；优选地，土壤经研磨至无颗粒状碎粒。
[0033]本发明还提供一种筛选木聚糖酶活性目标菌株的方法，包括以下步骤:
[0034]I)将胡萝卜切成片；
[0035]2)在胡萝卜片上刻划连续凹槽；
[0036]3)在所述的胡萝卜片凹槽中倾倒西红柿汁、样品液、底物混合液，三者的体积比为300:100:1，使上述混合液均勾分布于凹槽内；
[0037]4)在室温下静置培养2-4天；
[0038]5)取得在所述微生物甄别培养基的表面形成创伤的微生物；
[0039]6)将步骤5)得到的微生物进行透明圈法复筛。
[0040]上述混合液的制作方法为:将西红柿经匀浆器研磨至无颗粒状碎片，过滤取滤液，所述滤液灭菌后即得所述西红柿汁；所述底物为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别配制的燕麦木聚糖、桦木木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖xylo-oligo 95P的等比混合溶液。
[0041]优选的，步骤(I)中的胡萝卜预先放置在培养皿中；
[0042]优选的，所述培养皿中预先铺有无菌滤纸或无菌纱布，所述无菌滤纸或无菌纱布含有无菌水。
[0043]优选的，步骤(3)所述样品液为:样品(土壤等固体物质需要先研磨，再用等体积无菌水萃取)适量，添加适量无菌玻璃珠，手动振荡5分钟后静置澄清I分钟，取上清液成为样品液。
[0044]优选的，步骤(3)中混合的过程包含:取西红柿汁、样品液、底物，三者的体积比为300:100:1。其中，将西红柿经匀浆器研磨至无颗粒状碎片，过滤取滤液，所述滤液灭菌后即得所述西红柿汁；所述底物为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别配制的燕麦木聚糖、桦木木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖xylo-oligo 95P的等比混合溶液。
[0045]优选地，所述待培养样品为土壤时，选取腐殖质含量较低的土壤；优选地，土壤经研磨至无颗粒状碎粒。
[0046]优选的，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH为5.8 ;
[0047]优选的，所述燕麦木聚糖、桦木木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖xylo-oligo95P的浓度均为0.6mg/ml ；
[0048]优选的，所述方法还包括步骤(6)，其中将步骤(5)得到的微生物进行透明圈法复筛。
[0049]优选的，所述方法还包括步骤(7)，其中将步骤(6)得到的微生物进行木聚糖酶活性定量复筛。
[0050]在本发明的一个优选的方面，所述的复筛除可用于筛选木聚糖酶产酶菌株外，还可用于甘露聚糖酶、果胶酶产酶菌株以及上述复合产酶菌株。
[0051]在本发明的另一个方面，提供了前文所述微生物甄别培养基在酶活性菌株的初筛中的用途；
[0052]优选的，所述的初筛是筛选木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶产酶菌株。
[0053]本发明的技术方案有以下的意想不到的益处:采用本方法，适合在野外作业，当天采集的样品，晚上回到酒店即可处理完毕，不需要将野外样品带回实验室，从而避免因温度、湿度等条件变化后，原始采集地的微生物发生了群体变化，以致一些稀有微生物资源得到忽视。
【附图说明】
[0054]图1是胡萝卜片表面凹槽刻画方案的示意图。
【具体实施方式】
[0055]实施例1
[0056]微生物甄别培养基的制备:
[0057]市售胡萝卜切成圆片，胡萝卜片的厚度D3为6-10mm，直径Dl = 50_70mm。在前述已经切好的胡萝卜片上，采用专用的机具刻划“Z”字型凹槽。凹槽大小与胡萝卜片外形相似，直径D2〈D1即可；如图1所述，胡萝卜片的厚度D3为6-10mm;凹槽深度:3臟，宽度:1mm。
[0058]在所述胡萝卜片凹槽中倾倒经过巴氏灭菌的营养