专利名称：一种树突状细胞疫苗制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种树突状细胞疫苗制备方法。
背景技术：
DC名为树突状细胞，它是机体重要的免疫细胞，在细胞免疫治疗上有着广泛的应用前景，在特异的肿瘤抗原刺激下，成熟的树突状细胞能表达多种细胞因子和趋化因子，如，MHC II分子HLA-DR，共刺激分子⑶80，⑶86等多种细胞因子，有效诱导抗原特异性和非特异性免疫应答反应，增强机体免疫功能。但DC在人外周血中比例很低，因此提高扩增倍数，增加成熟的树突状细胞数，对治疗效果起着关键的作用。
现在树突状细胞做的很热，常规技术是用GM-CSF+IL4，这种方法的扩增倍数不高，成熟度不高，一般成熟的树突状细胞数只能达到2X 106，成熟的树突状细胞纯度在60%，参见图I。也有采用加入Flt3来进行扩增的，但其中还会加入化学药物，而且扩增倍数及成熟度也并不高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于肿瘤治疗用的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法，有效提高树突状细胞扩增，使人PBMC中未成熟的树突状细胞在体外培养条件下扩增倍数提高，提高成熟度，且不添加化学药物，纯净度高。为实现上述目的，设计一种树突状细胞疫苗制备方法，其特征在于采用如下制备步骤(1)取17ml病患自体血，采用人淋巴细胞分离液分离出红细胞、单核淋巴细胞、血浆；
(2)用GT-T551无血清培养基调整单核淋巴细胞浓度为2X IO6个/ml ; (3)将调整好浓度的单核淋巴细胞以3ml/孔加入6孔板中，贴壁16小时；(4)吸弃6孔板的每个孔内的上层未贴壁细胞，在每个孔的下层即留下未成熟DC细胞；(5)再在6孔板的每个孔内分别加入DC培养基3ml，置于二氧化碳培养箱内，二氧化碳浓度为5 %，温度为37°C，培养2 3天；(6 )吸弃6孔板的每个孔内DC培养基一半I. 5ml，每个孔内再补充DC培养基I. 5ml，进行半量换液；(7)以第一次加入DC培养基开始计算的第6天，荷载自体肿瘤抗原，使6孔板的每个孔内的自体肿瘤抗原的浓度为20 μ g/ml ； (8)24小时后检测成熟DC细胞的数量和成熟度；所述的DC培养基由上述步骤(I)中分离出的自体血浆、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551无血清培养基所组成，其中自体血浆占整个DC培养基体积的I %，GM-CSF占整个DC培养基的浓度为50ng/ml，IL-4占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，Flt3占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，GT-T551无血清培养基占整个DC培养基体积的96%。本发明同现有技术相比，分离出的自体血浆再利用，用人血浆替换为离体的人AB血清；在该DC培养基中加入Flt3，可以增强刺激树突状细胞扩增倍数，成熟的树突状细胞数至少达到IX 107，成熟树突状细胞的成熟度> 85% ;解决了树突状细胞制备过程中细胞数量少，增殖慢的问题；用自身特异的肿瘤干细胞裂解液，作为肿瘤抗原，细胞的特异性杀伤力更强；且原料不添加额外的化学药物，纯净度高。
图I为原有的方法制备出的成熟的树突状细胞的纯度图。图2为采用本发明制备出的成熟的树突状细胞的纯度图。
具体实施例方式下面结合实例对本发明作进一步地说明。(I)取18ml病患自体血，取其中Iml病患自体血做流式细胞检测，用于治疗前免疫指标的评价，另外17ml病患自体血采用人淋巴细胞分离液分离出红细胞、单核淋巴细胞、 血浆；
(2)用GT-T551无血清培养基调整单核淋巴细胞浓度为2XIO6个/ml ；
(3)将调整好浓度的单核淋巴细胞以3ml/孔加入6孔板中，贴壁16小时；
(4)在6孔板的每个孔内吸弃上层非贴壁细胞，在每个孔内即留下下层贴壁的未成熟的DC细胞；
(5)再在6孔板的每个孔内分别加入DC培养基3ml,置于二氧化碳培养箱内，其中CO2浓度为5%，温度为37°C，培养2 3天；
(6)吸弃6孔板的每个孔内的DC培养基I.5ml，再另取I. 5ml的DC培养基放在每个孔
内；
(7)以第一次加入DC培养基开始计算的第6天，荷载病患自体肿瘤抗原，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗，其中6孔板的每个孔内的自体肿瘤抗原的浓度为20 μ g/ml ；
(8)24小时后检测成熟DC细胞的数量和成熟度。所述的DC培养基由上述步骤(I)中分离出的自体血浆、GM-CSF, IL_4、Flt3、GT-T551无血清培养基所组成，其中自体血浆占整个DC培养基的体积为1%，GM-CSF占整个DC培养基的浓度为50ng/ml，IL-4占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，Flt3占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，GT-T551无血清培养基占整个DC培养基的体积为96%。相对于原有技术取血量多，扩增倍数少的情况，本发明提供的这种新的肿瘤树突状细胞治疗性疫苗的制备方法，用于肿瘤的预防及治疗，具有取血量少、制备简便、细胞增殖数量多、疗效好、特异性杀伤力强的特点，其中成熟的树突状细胞数至少达到1X107，成熟树突状细胞的成熟度> 85%，参见图2。
权利要求
1.一种树突状细胞疫苗制备方法，其特征在于采用如下制备步骤(I)取17ml病患自体血，采用人淋巴细胞分离液分离出红细胞、单核淋巴细胞、血浆；(2)用GT-T551无血清培养基调整单核淋巴细胞浓度为2X IO6个/ml ; (3)将调整好浓度的单核淋巴细胞以3ml/孔加入6孔板中，贴壁16小时 ；(4)吸弃6孔板的每个孔内的上层未贴壁细胞，在每个孔的下层即留下未成熟DC细胞；(5)再在6孔板的每个孔内分别加入DC培养基3ml，置于ニ氧化碳培养箱内，ニ氧化碳浓度为5%，温度为37 °C，培养2 3天；(6)吸弃6孔板的每个孔内DC培养基一半I. 5ml，每个孔内再补充DC培养基I. 5ml，进行半量换液；(7)以第一次加入DC培养基开始计算的第6天，荷载自体肿瘤抗原，使6孔板的每个孔内的自体肿瘤抗原的浓度为20 μ g/ml ; (8) 24小时后检测成熟DC细胞的数量和成熟度；所述的DC培养基由上述步骤(I)中分离出的自体血浆、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551无血清培养基所组成，其中自体血浆占整个DC培养基体积的I %，GM-CSF占整个DC培养基的浓度为50ng/ml，IL-4占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，Flt3占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，GT-T551无血清培养基占整个DC培养基体积的96%。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种树突状细胞疫苗制备方法，其特征在于采用如下制备步骤(1)取病患自体血，采用人淋巴细胞分离液分离出红细胞、单核淋巴细胞、血浆；(2)调整单核淋巴细胞浓度；(3)加入6孔板中，贴壁16小时；(4)吸弃6孔板的每个孔内的上层未贴壁细胞；(5)加入DC培养基3ml，置于二氧化碳培养箱内，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃，培养2～3天；(6)进行半量换液；(7)第6天，荷载自体肿瘤抗原，使6孔板的每个孔内的自体肿瘤抗原的浓度为20μg/ml；(8)24小时后检测成熟DC细胞的数量和成熟度。本发明同现有技术相比，成熟的树突状细胞数至少达到1×107，成熟度＞85%。
文档编号C12N5/0784GK102847145SQ20121037007
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者储以微, 郑秀娟, 张丹 申请人:复旦大学