一种转基因耐旱水稻的培育方法与流程

本发明涉及植物转基因
技术领域：
，具体涉及一种转基因耐旱水稻的培育方法。
背景技术：
环境因素在植物生长过程中具有重要影响，干旱、高盐、极端温度等会导致农作物的大规模减产，是许多地区制约农业发展的重要因素。培育抗逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应。水稻是重要的粮食作物，而干旱是影响水稻产量的重要因素之一，因此培育具有耐旱能力的水稻品种对提高粮食产量、保证国家粮食安全都具有重要意义。现有技术中，提高水稻耐旱能力的途径主要有三种，首先是基于人工筛选的方法，从天然水稻幼苗或杂交水稻幼苗中选择具有良好耐旱能力的个体，深度驯化或进一步杂交，逐步获得耐旱型水稻品种；此外，在栽培方法层面，通过对浸种、播种、土壤管理、水肥管理等条件进行探索优化，以降低植物的水分的需求量，提高土壤中水分利用率；第三种方法是基于转基因技术，将具有耐旱特征的基因引入水稻基因组并得到表达，或从水稻基因组中确定目的基因，对其调控机制加以干预，旨在获得耐旱的外在表型。以上方法中，人工筛选的方法缺乏针对性，因此要获得理想的品种往往需要大量的样本支撑，而且其耐旱能力的进展需要在代际间得到体现，因此时间和工作量投入极大，成功率不高；而栽培方法的优化对水稻耐旱能力提升作用有限，而且效果不稳定，受环境、水稻品种等条件影响较大；转基因方法由于具有较强的针对性，因此只要成功表达并得到稳定遗传，即可确立耐旱型新品种，受环境条件的影响也较小。然而，通过转基因技术获得耐旱型水稻具有突出的技术难度，首先，要确定对水稻耐旱能力具有直接影响的目的基因，而且，目的基因如何与水稻基因组进行重组并得到稳定表达，第三，所采用的基因重组手段不能影响水稻的产量、营养、口感等特征。现有技术中，尽管有研究者进行了诸多研究，但仍未获得理想的耐旱型水稻品种。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种转基因耐旱水稻的培育方法，以解决现有技术中人工筛选的方法工作量较大、耐旱能力提升有限的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是栽培工艺优化的方法对水稻耐旱能力提升有限、效果不稳定。本发明要解决的再一技术问题是确定一种对水稻耐旱能力具有显著影响的外源基因。本发明要解决的又一技术问题是如何使上述外源基因与水稻基因组重组并稳定表达。本发明要解决的又一技术问题是在通过转基因技术培育耐旱水稻的同时不影响水稻产量、营养成分、口感等特征。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种转基因耐旱水稻的培育方法，包括以下步骤：1)挑取副溶血性弧菌单菌落，接种于10mllb培养基中，在光照条件下，以35℃的温度，150rpm的转速摇瓶培养，至od660处吸光度为1.2时，以5000rpm的转速离心3min，向沉淀物中加入5ml以下成分的灭菌后的溶液：葡萄糖0.99g，1mol/l的tris·hcl25ml，0.5mol/l的edta20ml，加ddh2o定容至100ml；重悬沉淀，再向其中加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，在37℃条件下孵育30min，加入蛋白酶k至浓度为0.3mg/ml，继续在37℃条件下孵育4h，而后用等体积的酚-氯仿混合液抽提2次，用无水乙醇沉淀核酸，抽干后待用；2)以步骤1)所得产物为模板，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-tagacgggtatagcgagactgt-3’；5’-atcaagcactgcccatgatac-3’；得到第一目的基因；3)提取四尾栅藻总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-attctgcctagctcggacttc-3’；5’-gcccccgtattgcttagggta-3’；得到第二目的基因；4)用限制性内切酶hindiii分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的dna片段：5’-cgcattaatctattcgggattccgactgcagg-3’；用限制性内切酶asei分别酶切该dna片段以及所述第三目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到多元表达基因；5)用限制性内切酶bamhi与psti同时酶切所述多元表达基因和pcambia3301载体，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到多元质粒表达载体；6)取籼型水稻种子去壳，用70％的乙醇浸泡1分钟，而后用0.15％氯化汞浸泡15分钟；用灭菌水清洗种子5次，将种子放在诱导培养基上，以28℃的温度避光培养4～6周，得到水稻苗愈伤组织；而后将所述水稻苗愈伤组织在无菌条件下剪碎，加入bg11培养基悬浮，再向其中加入果胶酶至终浓度为0.05g/ml，在超声震荡条件下以27℃的温度、1500lux的照度、220rpm的转速摇瓶孵育2d，而后以50μm孔径的滤器在无菌条件下滤除固形物，收集悬浮液即为离体水稻细胞；7)制备感受态的农杆菌，将步骤5)所得的多元质粒表达载体采用转化方法导入所述农杆菌中，筛选阳性克隆，即为重组农杆菌；8)利用步骤7)所得的重组农杆菌侵染步骤6)所得的离体水稻细胞，而后筛选阳性克隆，在b5培养基中培养得到愈伤组织，而后将愈伤组织转入ms培养基生根，得到转基因耐旱水稻幼苗。作为优选，步骤1)中，酚-氯仿混合液中酚与氯仿的体积比为27:20。作为优选，步骤2)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，100ng模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤2)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性2min；93℃变性30s，66℃退火1min，73℃延伸2min，30个循环；72℃最后延伸5min。作为优选，步骤3)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，1μl模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤3)中pcr扩增反应条件为：91℃预变性2min；96℃变性30s，62℃退火1min，73℃延伸3min，35个循环；77℃最后延伸5min。作为优选，步骤6)所述籼型水稻为杂交水稻，其品种为y两优087或宜香4245。作为优选，步骤7)中感受态的农杆菌是通过以下方法制备的：取农杆菌接种于含有50μg/ml利福平的yep液体培养基中，培养至菌液od660值0.4；将菌液冰浴30min后，离心取沉淀；用0.15mmol/l的氯化钠溶液l0ml重悬沉淀，而后离心取沉淀，再悬浮于20mmol/l的氯化钙溶液中。作为优选，步骤7)中所述转化方法包括以下步骤：取1μg所述多元质粒表达载体加入到200μl感受态的农杆菌中，混合后冰浴30min；液氮中冷冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μlyep液体培养基，28℃培养3h；而后离心收集菌体。作为优选，步骤7)中所述转化方法包括以下步骤：在电转杯中，将3μg所述多元质粒表达载体与100μl感受态的农杆菌混合，而后以电压1.5kv、电阻220ω、电容24uf的条件电转5.2ms。作为优选，步骤7)与步骤8)中所述筛选阳性克隆的方法，均为提取dna后进行测序。作为优选，步骤6)所述诱导培养基包括以下成分nh4no31650mg/l，kno31900mg/l，cacl2·2h2o440mg/l，ki0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，肌醇9.3mg/l，硫胺素22mg/l，聚乙烯酰胺0.5mg/l，吡哆醇15mg/l，泛酸钙6.8mg/l，钴胺素2.5mg/l，天冬氨酸1.7mg/l，叶酸21mg/l。在以上技术方案中，副溶血性弧菌、四尾栅藻、农杆菌为常规菌株，购自中国工业微生物菌株保藏管理中心。所述hindiii、asei、bamhi、psti为常规的限制性核酸内切酶，上述酶制剂以及t4dna连接酶均购自华大基因科技服务有限公司。所述pcambia3301载体为常规市售产品，购自上海生工生物工程有限公司。序列为5’-cgcattaatctattcgggattccgactgcagg-3’的dna片段由本申请人设计，由上海生工生物工程有限公司合成。本发明提供了一种转基因耐旱水稻的培育方法，该技术方案首先研究了外源性dna与水稻基因重组的可行性，以此为依托，对各类外源基因进行了筛选。意外发现整合有副溶血性弧菌部分cdna以及四尾栅藻部分结构基因的dna片段对水稻叶片气孔具有调节作用，同时能在叶片表面产生蜡质，从而对叶片失水具有一定的抑制作用。在此基础上，针对异源表达不稳定的问题，本发明对上述dna片段进行了结构改进，利用asei将末端部分碱基切除，并设计了替换性序列，将其以pcambia3301质粒为载体，首先转化至感受态的农杆菌中，而后侵染离体的水稻胚细胞，筛选阳性克隆经组织培养发育成为转基因水稻幼苗。通过以上结构改进，可提高异源表达的稳定性，同时，有助于生理表型在代际间的稳定遗传。实验结果表明，本发明培育的转基因幼苗对环境水分的需求量大幅降低，可适应高度干旱的土壤环境，而大米产量较亲本几乎不存在变化，同时，其基础营养成分和口感与亲本籼米保持一致。附图说明图1是本发明具体实施方式中各实验组水稻叶片气孔平均面积检测结果图；图2是本发明具体实施方式中各实验组水稻叶片气孔覆盖率检测结果图；图3是本发明具体实施方式中各实验组水稻叶片表面蜡质含量检测结果图；图4是本发明具体实施方式中各实验组水稻叶片卷曲程度评价结果图；图5是本发明具体实施方式中各实验组水稻最终产量数据图；图6是本发明具体实施方式中各实验组所产大米营养成分检测结果图；图7是本发明具体实施方式中传代后较传代前各实验组水稻产量变化率检测结果图。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。实施例1一种转基因耐旱水稻的培育方法，包括以下步骤：1)挑取副溶血性弧菌单菌落，接种于10mllb培养基中，在光照条件下，以35℃的温度，150rpm的转速摇瓶培养，至od660处吸光度为1.2时，以5000rpm的转速离心3min，向沉淀物中加入5ml以下成分的灭菌后的溶液：葡萄糖0.99g，1mol/l的tris·hcl25ml，0.5mol/l的edta20ml，加ddh2o定容至100ml；重悬沉淀，再向其中加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，在37℃条件下孵育30min，加入蛋白酶k至浓度为0.3mg/ml，继续在37℃条件下孵育4h，而后用等体积的酚-氯仿混合液抽提2次，用无水乙醇沉淀核酸，抽干后待用；2)以步骤1)所得产物为模板，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-tagacgggtatagcgagactgt-3’；5’-atcaagcactgcccatgatac-3’；得到第一目的基因；第一目的基因的测序结果如序列seqidno:6所示；3)提取四尾栅藻总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-attctgcctagctcggacttc-3’；5’-gcccccgtattgcttagggta-3’；得到第二目的基因；第二目的基因的测序结果如序列seqidno:7所示；4)用限制性内切酶hindiii分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的dna片段：5’-cgcattaatctattcgggattccgactgcagg-3’；用限制性内切酶asei分别酶切该dna片段以及所述第三目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到多元表达基因；第三目的基因和多元表达基因的测序结果分别如序列seqidno:8、seqidno:9所示；5)用限制性内切酶bamhi与psti同时酶切所述多元表达基因和pcambia3301载体，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到多元质粒表达载体；6)取籼型水稻种子去壳，用70％的乙醇浸泡1分钟，而后用0.15％氯化汞浸泡15分钟；用灭菌水清洗种子5次，将种子放在诱导培养基上，以28℃的温度避光培养4～6周，得到水稻苗愈伤组织；而后将所述水稻苗愈伤组织在无菌条件下剪碎，加入bg11培养基悬浮，再向其中加入果胶酶至终浓度为0.05g/ml，在超声震荡条件下以27℃的温度、1500lux的照度、220rpm的转速摇瓶孵育2d，而后以50μm孔径的滤器在无菌条件下滤除固形物，收集悬浮液即为离体水稻细胞；7)制备感受态的农杆菌，将步骤5)所得的多元质粒表达载体采用转化方法导入所述农杆菌中，筛选阳性克隆，即为重组农杆菌；8)利用步骤7)所得的重组农杆菌侵染步骤6)所得的离体水稻细胞，而后筛选阳性克隆，在b5培养基中培养得到愈伤组织，而后将愈伤组织转入ms培养基生根，得到转基因耐旱水稻幼苗。步骤1)中，酚-氯仿混合液中酚与氯仿的体积比为27:20。步骤2)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，100ng模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤2)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性2min；93℃变性30s，66℃退火1min，73℃延伸2min，30个循环；72℃最后延伸5min。步骤3)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，1μl模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤3)中pcr扩增反应条件为：91℃预变性2min；96℃变性30s，62℃退火1min，73℃延伸3min，35个循环；77℃最后延伸5min。步骤6)所述籼型水稻为杂交水稻，其品种为宜香4245杂交籼稻。步骤7)中感受态的农杆菌是通过以下方法制备的：取农杆菌接种于含有50μg/ml利福平的yep液体培养基中，培养至菌液od660值0.4；将菌液冰浴30min后，离心取沉淀；用0.15mmol/l的氯化钠溶液l0ml重悬沉淀，而后离心取沉淀，再悬浮于20mmol/l的氯化钙溶液中。步骤7)中所述转化方法包括以下步骤：在电转杯中，将3μg所述多元质粒表达载体与100μl感受态的农杆菌混合，而后以电压1.5kv、电阻220ω、电容24uf的条件电转5.2ms。步骤7)与步骤8)中所述筛选阳性克隆的方法，均为提取dna后进行测序。步骤6)所述诱导培养基包括以下成分nh4no31650mg/l，kno31900mg/l，cacl2·2h2o440mg/l，ki0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，肌醇9.3mg/l，硫胺素22mg/l，聚乙烯酰胺0.5mg/l，吡哆醇15mg/l，泛酸钙6.8mg/l，钴胺素2.5mg/l，天冬氨酸1.7mg/l，叶酸21mg/l。实施例2一种转基因耐旱水稻的培育方法，该方法在实施例1所提供方法的基础上，仅以第一目的基因与pcambia3301载体采用双酶切后连接，不引入第二目的基因以及人工合成的dna片段，其余方法条件不变。实施例3一种转基因耐旱水稻的培育方法，该方法在实施例1所提供方法的基础上，仅以第二目的基因与pcambia3301载体采用双酶切后连接，不引入第一目的基因以及人工合成的dna片段，其余方法条件不变。实施例4一种转基因耐旱水稻的培育方法，该方法在实施例1所提供方法的基础上，仅以第三目的基因与pcambia3301载体采用双酶切后连接，不引入人工合成的dna片段，其余方法条件不变。实施例5本实施例用于考察以上实施例1～4所培育的转基因水稻以及亲本宜香4245籼型三系稻、市售中嘉早17常规籼稻在叶片质地、干旱耐受性、产量、营养成分、遗传稳定性等方面的特征。1、实验方法1.1水稻叶片气孔尺寸检测水稻齐穗时，每个株系中选取长势中等的3株剪取其主茎剑叶的中部保存在faa固定液中备用。取适宜长度的导电胶粘贴于tm1000台式扫描电镜载物台中心处，在剑叶中部剪取长度约0.5cm的样品，取3次重复，用试纸擦干，展平粘贴于导电胶上使剑叶背面朝上。在30放大倍率下确定观察对象然后在500放大倍率(380μm×285μm)下每片叶随机选取5点，每点观察1个视野；2500放大倍率下，在每视野随机选取3个气孔测量其平均面积。1.2水稻叶面蜡质的提取与含量测定根据两种溶剂的沸点，选择稍低于沸点的温度提取蜡质。称取2g新鲜的成熟叶片，画图法计算其表面积后，立即分别置于30ml60℃氯仿和67℃正己烷中，30s后马上取出。提取液自然挥发后，称取蜡质质量，计算蜡质含量。蜡质含量＝蜡质质量(μg)/稻叶表面积(cm2)。1.3水稻干旱耐受性实验供试的水稻品种于2017年4月12日播种，5月17日移栽，2次重复，顺序排列，2行区，每行15穴，单本插秧，插秧规格为26.7cm×13.3cm。在分蘖期(移栽后38天)开始进行干旱处理：抽去田间水，保持缺水率dw为-20％、-30％、-40％、-50％，dw＝(w-wr)wr×100％，其中w为计算期内可供灌溉的总水量(m3)，wr为同期灌溉总需水量(m3)。从7月17日开始每隔7天于上午11:00-12:00调查记载叶卷曲度到9月24日止。以干旱胁迫下叶卷曲度作为评价指标。1.4干旱条件对各水稻品种产量的影响在以上1.3节的实验条件下，于9月25日收获水稻，计算单位面积产量。1.5干旱条件对本发明水稻营养成分的影响对宜香4245杂交籼稻以常规栽培方法栽培，采集所产大米，作为对比组；同时采集实施例1水稻在缺水率dw为-50％的条件下所产大米。采用gb5009.9-2016检测其中淀粉含量；采用gb5009.5-2016检测其中蛋白质含量；采用gb5009.6-2016检测其中脂肪含量。1.6不同转基因条件的遗传稳定性对实施例1～4所获得的水稻，采用自交方式分别传代6次，以1.4节所规定的方法比较传代前后各水稻品种的单位面积产量变化率。2、实验结果2.1水稻叶片气孔尺寸检测结果实验结果如表1、表2和图1、图2所示：表1各实验组水稻叶片气孔平均面积(μm2)表2各实验组水稻叶片气孔面积占比(％)如表1、表2、图1、图2所示，仅重组目的基因1或目的基因2对水稻叶片气孔尺寸无显著影响，而将目的基因1与目的基因2整合后与水稻基因组重组则能显著降低水稻叶片气孔尺寸，同时对气孔在叶片表面的覆盖率具有降低作用，二者在降低水平方面趋于一致。2.2水稻叶面蜡质的提取与含量测定结果实验结果如以下表3和图3所示：表3各实验组水稻叶片表面蜡质含量(μg/cm2)如表3、图3所示，仅重组目的基因1或目的基因2对水稻叶片蜡质含量无显著影响，而将目的基因1与目的基因2整合后与水稻基因组重组则能显著提高水稻叶片蜡质含量，是否引入本发明所合成的dna片段对蜡质含量的提升未见明显差异。2.3水稻干旱耐受性实验水稻叶片卷曲程度评价标准如以下表4所示：表4叶片卷曲程度评价标准叶卷曲程度定级田间旱胁迫叶卷曲程度耐旱性评价1叶健康极强3开始出现卷曲，叶折起呈v型强5叶呈杯状(u形)折起中7叶边结合(呈o型)弱9叶完全卷曲极弱实验结果如以下表5和图4所示：表5各实验组水稻叶片卷曲程度级别实验组\缺水率-20％-30％-40％-50％实施例11111实施例23799实施例33779实施例41111宜香42453779中嘉早175799如表5、图4所示，在各级缺水条件下，本发明所培育的转基因水稻(实施例1)均表现出了良好的抗逆性，生长状况良好；同时，重组有第三目的基因(实施例4)的转基因水稻也表现出了同等的耐旱能力。而仅重组第一目的基因或第二目的基因则不会为水稻耐旱能力起到增益作用，与天然杂交籼稻宜香4245、中嘉早17生长状况处于同一水平，均难以耐受30％以上的缺水等级。2.4干旱条件对各水稻品种产量的影响实验结果实验结果如以下表6和图5所示：表6各实验组水稻最终产量(公斤/亩)实验组\缺水率-20％-30％-40％-50％实施例1789776754767实施例2624533310228实施例3615492291150实施例4762773785770宜香4245621516344237中嘉早17634542325188如以上表6所示，在各级缺水条件下，本发明所培育的转基因水稻(实施例1)均表现出了良好的抗逆性，产量未受干旱条件影响；同时，重组有第三目的基因(实施例4)的转基因水稻也表现出了同等的耐旱能力，产量与实施例1处于同一水平。由于宜香4245在常规种植条件下产量约为750～850kg/亩，因此以上实验结果表明本发明所培育的水稻幼苗在高达-50％缺水率的情况下仍能达到正常产量水平。另一方面，仅重组第一目的基因或第二目的基因则不会为水稻耐旱能力起到增益作用，与天然杂交籼稻宜香4245、中嘉早17生长状况处于同一水平，在干旱条件下产量受到严重影响。2.5干旱条件对本发明水稻营养成分的影响实验结果实验结果如以下表7和图6所示：表7各实验组所产大米营养成分如以上表6所示，与常规宜香4245在水分充足条件下所产大米相比，实施例1水稻在缺水率dw为-50％的条件下所产大米，在淀粉、蛋白质、脂肪等方面未见明显差异，因此有理由相信在营养成分方面本发明所培育的水稻所产大米并不逊于常规水稻所产大米。2.6不同转基因条件的遗传稳定性实验结果如以下表8和图7所示：表8传代后较传代前各实验组水稻产量变化率(％)实验组\缺水率-20％-30％-40％-50％实施例1100.8％100.3％99.7％98.9％实施例298.6％99.2％97.8％100.1％实施例397.9％101.3％100.5％101.6％实施例485.2％72.1％46.3％31.4％如表8所示，本发明所提供的转基因水稻(实施例1)具有良好的传代稳定性，传代6次以上仍能保持与亲代同等的耐旱水平，在各级干旱条件下产量未受影响。而仅重组第三目的基因、未引入合成的dna片段的实验组(实施例4)，在传动6次后，其耐旱能力基本丧失，随着干旱水平的提升，产量急剧下降，不再表现出抗旱能力。综上所述，本发明所培育的转基因水稻，其叶片气孔面积和气孔覆盖率显著下降，同时叶片表面蜡质增多，从而提升了水稻的抗旱能力。直接通过干旱胁迫实验证明，在高达-50％的缺水率条件下，水稻生长状况及最终产量均与常规栽培条件处于同一水平。此外，本发明所培育的转基因水稻，尽管其耐旱能力显著提升，但在淀粉、蛋白质、脂肪等方面未见明显差异，因此有理由相信在营养成分方面本发明所培育的水稻所产大米并不逊于常规水稻所产大米。另外，本发明通过整合特定的dna片段，使得耐旱能力的遗传稳定性得到意外的提升，从而保证了本发明应用于农业生产的可行性和有效性。实施例6一种转基因耐旱水稻的培育方法，包括以下步骤：1)挑取副溶血性弧菌单菌落，接种于10mllb培养基中，在光照条件下，以35℃的温度，150rpm的转速摇瓶培养，至od660处吸光度为1.2时，以5000rpm的转速离心3min，向沉淀物中加入5ml以下成分的灭菌后的溶液：葡萄糖0.99g，1mol/l的tris·hcl25ml，0.5mol/l的edta20ml，加ddh2o定容至100ml；重悬沉淀，再向其中加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，在37℃条件下孵育30min，加入蛋白酶k至浓度为0.3mg/ml，继续在37℃条件下孵育4h，而后用等体积的酚-氯仿混合液抽提2次，用无水乙醇沉淀核酸，抽干后待用；2)以步骤1)所得产物为模板，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-tagacgggtatagcgagactgt-3’；5’-atcaagcactgcccatgatac-3’；得到第一目的基因；3)提取四尾栅藻总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-attctgcctagctcggacttc-3’；5’-gcccccgtattgcttagggta-3’；得到第二目的基因；4)用限制性内切酶hindiii分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的dna片段：5’-cgcattaatctattcgggattccgactgcagg-3’；用限制性内切酶asei分别酶切该dna片段以及所述第三目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到多元表达基因；5)用限制性内切酶bamhi与psti同时酶切所述多元表达基因和pcambia3301载体，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到多元质粒表达载体；6)取籼型水稻种子去壳，用70％的乙醇浸泡1分钟，而后用0.15％氯化汞浸泡15分钟；用灭菌水清洗种子5次，将种子放在诱导培养基上，以28℃的温度避光培养4～6周，得到水稻苗愈伤组织；而后将所述水稻苗愈伤组织在无菌条件下剪碎，加入bg11培养基悬浮，再向其中加入果胶酶至终浓度为0.05g/ml，在超声震荡条件下以27℃的温度、1500lux的照度、220rpm的转速摇瓶孵育2d，而后以50μm孔径的滤器在无菌条件下滤除固形物，收集悬浮液即为离体水稻细胞；7)制备感受态的农杆菌，将步骤5)所得的多元质粒表达载体采用转化方法导入所述农杆菌中，筛选阳性克隆，即为重组农杆菌；8)利用步骤7)所得的重组农杆菌侵染步骤6)所得的离体水稻细胞，而后筛选阳性克隆，在b5培养基中培养得到愈伤组织，而后将愈伤组织转入ms培养基生根，得到转基因耐旱水稻幼苗。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江西新海粮油有限公司<120>一种转基因耐旱水稻的培育方法<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tagacgggtatagcgagactgt22<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atcaagcactgcccatgatac21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3attctgcctagctcggacttc21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcccccgtattgcttagggta21<210>5<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cgcattaatctattcgggattccgactgcagg32<210>6<211>349<212>dna<213>副溶血性弧菌(vibrioparahemolyticus)<400>6gattggatcctcgatttgtgccttttagaggatttatggttgtttcctgggtctttgtgg60cctttggtgattcttgttctggatgagacgcgtatataattagctctaaatcctcgataa120atcatgcatcgcggtaagccctcttcgccggtagagcttctttctttagcttctgctata180gctttggtttcttctttagcagtggattttgtgacttttcttaagattctcgaggtaccc240gagtttgatataaccttcgcttgcattctgagcgcttaagcttatattcttatttgggaa300gctggggagaatgcttagctaattagggcgctctgtgagcatttttgtt349<210>7<211>662<212>dna<213>四尾栅藻(scenedesmusquadricauda)<400>7tataatgttggctttaacaaatccaagcacgaagtgcagacgacaatctccaggaaaacc60aagcttacaagtctgacgcgataacccactaaaagcagtatgacttagttgatgacgaag120tacagaaggactacttaccttccaatgtttatcataaggcagactgaatccgctaaataa180aatgcttagaacagttggagctatgcaaagctggtccacttggactcgcgaaaatgaatg240ggaaaggtggctcgaaagtagtgaaactagtctccgcactttctggtcctccgaaactgg300ggggtgggaatggtgctgagaatgggccgggtggtggccctccgaataagcaagtggcgc360ctgggggggcactggggtaactgaattcactgactattcttacaccttggttatacttaa420tgaggaacatgacgagcaagttgagctttgccagactacactagtgcacataaagcagga480gttgatgcacatcacacgcttccggttgctctagtcaagagctacaacataaaattaata540cttcaggacctgcaggtggaagttgaggaaatataccctatcaatagttcttcggaacag600atacatacgggggataataatagccagaagcaacataatgattggcaaaaggttcacgcc660ga662<210>8<211>879<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gattggatcctcgatttgtgccttttagaggatttatggttgtttcctgggtctttgtgg60cctttggtgattcttgttctggatgagacgcgtatataattagctctaaatcctcgataa120atcatgcatcgcggtaagccctcttcgccggtagagcttctttctttagcttctgctata180gctttggtttcttctttagcagtggattttgtgacttttcttaagattctcgaggtaccc240gagtttgatataaccttcgcttgcattctgagcgcttaagcttacaagtctgacgcgata300acccactaaaagcagtatgacttagttgatgacgaagtacagaaggactacttaccttcc360aatgtttatcataaggcagactgaatccgctaaataaaatgcttagaacagttggagcta420tgcaaagctggtccacttggactcgcgaaaatgaatgggaaaggtggctcgaaagtagtg480aaactagtctccgcactttctggtcctccgaaactggggggtgggaatggtgctgagaat540gggccgggtggtggccctccgaataagcaagtggcgcctgggggggcactggggtaactg600aattcactgactattcttacaccttggttatacttaatgaggaacatgacgagcaagttg660agctttgccagactacactagtgcacataaagcaggagttgatgcacatcacacgcttcc720ggttgctctagtcaagagctacaacataaaattaatacttcaggacctgcaggtggaagt780tgaggaaatataccctatcaatagttcttcggaacagatacatacgggggataataatag840ccagaagcaacataatgattggcaaaaggttcacgccga879<210>9<211>779<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gattggatcctcgatttgtgccttttagaggatttatggttgtttcctgggtctttgtgg60cctttggtgattcttgttctggatgagacgcgtatataattagctctaaatcctcgataa120atcatgcatcgcggtaagccctcttcgccggtagagcttctttctttagcttctgctata180gctttggtttcttctttagcagtggattttgtgacttttcttaagattctcgaggtaccc240gagtttgatataaccttcgcttgcattctgagcgcttaagcttacaagtctgacgcgata300acccactaaaagcagtatgacttagttgatgacgaagtacagaaggactacttaccttcc360aatgtttatcataaggcagactgaatccgctaaataaaatgcttagaacagttggagcta420tgcaaagctggtccacttggactcgcgaaaatgaatgggaaaggtggctcgaaagtagtg480aaactagtctccgcactttctggtcctccgaaactggggggtgggaatggtgctgagaat540gggccgggtggtggccctccgaataagcaagtggcgcctgggggggcactggggtaactg600aattcactgactattcttacaccttggttatacttaatgaggaacatgacgagcaagttg660agctttgccagactacactagtgcacataaagcaggagttgatgcacatcacacgcttcc720ggttgctctagtcaagagctacaacataaaattaatctattcgggattccgactgcagg779当前第1页12