微生物固定化凝胶球的制备及其对水中诺氟沙星和四环素的去除的制作方法

本发明涉及微生物固定化凝胶球的制备方法，属于水处理药剂制备和医药废水处理技术领域。

背景技术

近年来，抗生素被广泛应用于人类和动物的疾病治疗中，诺氟沙星和四环素因具广谱抗菌作用而被大量使用。然而由于人类及动物对大多数抗生素的代谢和吸收都很差，大部分抗生素通过尿液和粪便排出体外。目前科学家已在土壤、地表水、地下水中检测到抗生素的存在，即使低浓度的抗生素也能导致抗性基因的产生和传播，对人类和动物具有慢性毒性，可降低人体和动物的免疫力并提高耐药性，严重危害人类和动物的健康。因此，去除水中的抗生素迫在眉睫。

目前，水环境中抗生素的去除日益受到关注，其中吸附法因其投资少、操作简单、快速且易于广泛应用而成为最主要采用的方法。但吸附法只是将抗生素从水相转移到固相中，不能将其彻底去除，单独使用吸附法易造成二次污染。生物降解是抗生素在环境中降解的最重要途径，被生物降解的抗生素可转化为没有生物毒性的无机或有机小分子。

技术实现要素：

为了克服上述不足，本发明提供一种制备工艺简单、原料绿色环保且能将废料变废为宝的微生物固定化凝胶球的制备方法。本发明的目的还在于提供一种微生物固定化凝胶球去除水中抗生素的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种能降解诺氟沙星和/或四环素的微生物固定化凝胶球的制备方法，包括：

从牛粪便中培养驯化，得到能降解(诺氟沙星和/或四环素)抗生素的微生物；

在厌氧条件下，将上述微生物、焙烧水滑石cldh加入到海藻酸钠溶液中，混合均匀，形成悬浊液；

在厌氧条件下，将上述悬浊液加入到cacl2溶液中，反应、固化，形成凝胶球、洗涤，即得；

在一些实施例中，厌氧条件可以通过以下方式获得：将微生物在支口锥形瓶中培养，其中，一个口用来换水，一个口用来连接一个三通阀门，三通阀门的一个口连接集气装置，集气装置为一大一下塑料瓶对扣而成，采用排水法测量产气量。整个装置中即为厌氧状态。如图2所示。

所述微生物、cldh和sa的质量比为10～20：6～8：1.5～2。

为了提高从牛粪驯化、培养获得的微生物对诺氟沙星和四环素的耐受能力和降解能力，本申请试图将该微生物(抗诺氟沙星和四环素)制成凝胶球，但研究发现:由于微生物对不同固定化载体形成的微环境的适应能力以及对载体附着能力的不同，固定化对微生物群落结构产生较大影响。为了保证包埋后微生物(抗诺氟沙星和四环素)具有较好的吸附效果和生物活性，本申请系统研究了多种包埋载体对抗诺氟沙星和四环素的微生物耐受能力和降解能力的影响，经过大规模实验摸索发现：利用焙烧水滑石(cldh)良好的吸附性能，通过海藻酸钠作为包埋剂、氯化钙作为交联剂，将微生物(抗诺氟沙星和四环素)包埋形成的凝胶球具有较好的吸附性和生物稳定性。

与以海藻酸钠为主要包埋载体不同，本申请中凝胶球的主要成分为焙烧水滑石(cldh)，添加少量的海藻酸钠主要起到交联、固化，使焙烧水滑石(cldh)成型的目的，因此，本申请也具有远高于海藻酸钠基凝胶球的机械强度和力学稳定性。

在一些实施例中，所述悬浊液加入到cacl2溶液的具体步骤为：采用蠕动泵将微生物、焙烧水滑石cldh和海藻酸钠的混合溶液逐滴加入到20-40℃水浴、不断搅拌的cacl2溶液中，搅拌1～6h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化12～48h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球。

在一些实施例中，所述反应温度、反应时间和固化时间为40℃：2h：24h。

在一些实施例中，能降解抗生素的微生物培养驯化的具体步骤是将粪便加入到密封的产气培养装置中，并加入含诺氟沙星或四环素的废水进行培养驯化，每天对上清液进行换水并添加1mg/l对应的抗生素，便于产生能抵抗该抗生素的优势菌种。定期观察气体产生情况，当产生甲烷时说明已筛选出抵抗该抗生素的微生物，继续培养至装置内系统稳定，微生物足够多时取出装置内的微生物进行固定化实验，此时装置内微生物含量为30％，即：微生物菌液的菌种浓度为2.1×10⁸cells/ml。

在一些实施例中，所述抗生素为诺氟沙星和/或四环素。

由于海藻酸钠的强度较低，特别是在厌氧条件下易被微生物分解。因此，本申请在焙烧水滑石(cldh)加入少量的麦饭石，利用其海绵状多孔结构对微生物的在厌氧下的生物活性进行调控，抑制海藻酸钠的分解。结果表明：凝胶球力学稳定性提高、更利于对诺佛沙星或四环素的去除和生物活性的保持。因此，在一些实施例中，所述凝胶球还包括：0.1～0.3％的麦饭石，其粒径为40-70目。

本发明的目的之二是提供了任一上述的方法制备的固定化凝胶球。

本申请还提供了一种可用于处理诺氟沙星和/或四环素的凝胶球，其由cldh和sa组成，二者的质量比为6～8：1.5～2；制备方法如下：

将焙烧水滑石cldh加入到海藻酸钠溶液中，混合均匀，形成悬浊液；

将上述悬浊液加入到cacl2溶液中，反应、固化，形成凝胶球、洗涤，即得。

本发明的目的之三是提供了一种采用上述的微生物固定化凝胶球对水中抗生素的去除的方法，其特征在于，包括：

向抗生素溶液加入微生物固定化凝胶球进行4-48h的振荡。

在一些实施例中，所述抗生素溶液的浓度为8-12mg/l。

在一些实施例中，所述抗生素为诺氟沙星和/或四环素。

一种水处理药剂，包括：任一上述的凝胶球。

本发明的有益效果

(1)本发明通过凝胶技术将可降解抗生素的微生物固定在凝胶球中，不仅提高了固定化微生物对有毒物质的耐受能力和降解能力,还可以避免微生物随出水而流失，可以长期维持较高的微生物浓度，增强水处理系统的抗干扰能力和稳定性。

(2)本发明在较小的凝胶球投加量下即可实现抗生素的高效去除，去除率最高可达到100％。

(3)该方法所制备的未添加cldh的微生物固定化凝胶球对诺氟沙星和四环素的吸附效果较未添加cldh且未固定微生物的凝胶球高出10％以上的吸附效果；此外，该方法所制备的添加cldh的微生物固定化凝胶球对诺氟沙星和四环素的吸附效果与添加cldh且未固定微生物的凝胶球相当。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是本发明的微生物固定化凝胶球对诺氟沙星和四环素的去除效果图。其中，1-5依次为：0％微生物-0％cldh-sa凝胶球，15％微生物-0％cldh-sa凝胶球，20％微生物-0％cldh-sa凝胶球，0％微生物-8％cldh-sa凝胶球，15％微生物-8％cldh-sa凝胶球。

图2是本申请的厌氧培养装置。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明的方法是采用培养驯化的方法得到可降解抗生素的微生物，并通过凝胶技术将微生物固定在sa凝胶球中，从而制得微生物固定化凝胶球，并将其用于水体中抗生素的去除。

微生物固定化凝胶球的制备及其对水中诺氟沙星和四环素的去除，包括以下步骤：

(1)选取牛的粪便进行微生物的培养驯化。具体步骤是将粪便加入到密封的产气培养装置中，并加入含诺氟沙星或四环素的废水进行培养驯化，每天对上清液进行换水并添加1mg/l对应的抗生素，便于产生能抵抗该抗生素的优势菌种。定期观察气体产生情况，当产生甲烷时说明已筛选出抵抗该抗生素的微生物，继续培养至装置内系统稳定，微生物足够多时取出装置内的微生物进行固定化实验，此时装置内微生物含量为30％。

(2)将sa溶于去离子水中不断搅拌并超声分散，得到均一透明的胶状溶液；

(3)在厌氧条件下，将筛选出的微生物和cldh添加到步骤(2)的溶液中，不断搅拌，静置脱泡，得到均一悬浊液；

(4)将cacl2溶于去离子水中得到均一透明溶液；

(5)在厌氧条件下，采用蠕动泵将步骤(3)的溶液逐滴加入到20-40℃水浴、不断搅拌的步骤(4)溶液中，搅拌1～6h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化12～48h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球。

本发明的制备方法以sa为包埋剂，cacl2为交联剂，微生物和cldh为有效成分，成功合成微生物固定化凝胶球。通过控制微生物和cldh的含量、反应温度、反应时间和固化时间得到性能优越的微生物固定化凝胶球。

其中，cldh不仅可以发挥良好的吸附性能，还能改善凝胶球的内部结构。为了提高合成效率同时获得高性能的微生物固定化凝胶球，微生物和cldh的含量优选为15％：8％；反应温度、反应时间和固化时间优选为40℃：2h：24h。

所述cldh还加入0.1～0.3wt％的麦饭石，其粒径为40-70目。

所述的微生物固定化凝胶球对水中抗生素的去除步骤如下：

移取浓度为10mg/l的抗生素溶液20ml于50ml离心管中，添加20个微生物固定化凝胶球进行4-48h的振荡，静置后取上清液检测抗生素的浓度，根据溶液中抗生素的初始浓度和吸附后的剩余浓度计算抗生素的去除率。

上述抗生素选自下列之一：诺氟沙星和四环素。

实施例1：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)将0.4gsa溶于20ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到质量体积分数为2％的sa均一透明的胶状溶液；

(2)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(3)将步骤(1)的溶液通过蠕动泵逐滴加入到20℃水浴、不断搅拌的步骤(2)溶液中，持续搅拌1h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化12h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球1：0％微生物-0％cldh-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为37.2％、51.6％和56.6％，对四环素的去除率分别为27.6％、38.3％和45.6％。

实施例2：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)选取牛的粪便进行微生物的培养驯化。具体步骤是取牛的粪便加入到密封的产气培养装置中，采用含诺氟沙星或四环素的模拟废水进行培养驯化，培养驯化阶段温度保持在37℃，每天更换的抗生素抗生素(诺佛沙星或四环素)模拟废水浓度为1mg/l。每天早晚定期观察气体产生情况，经过7d的培养驯化，在采气口收集到了甲烷气体约10-20ml，说明已筛选出能抵抗该抗生素的微生物，继续培养驯化该微生物并每天监测ph值、产气量和抗生素浓度。经过约30d左右的驯化培养，ph值稳定在7.5左右，产气量为110-130ml/d，进水抗生素(诺佛沙星或四环素)去除率为80％左右，即培养装置中的状态已基本保持不变，说明培养驯化完成，微生物量满足后续实验需要，此时装置内混合液中微生物含量约为30％。

(2)将0.4gsa溶于10ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到均一透明的sa胶状溶液；

(3)在厌氧条件下，取10ml步骤(1)筛选出的微生物溶液至步骤(2)的溶液中，不断搅拌，静置脱泡，得到微生物浓度为15％，sa质量分数为2％的均一悬浊液；

(4)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(5)在厌氧条件下，采用蠕动泵将步骤(3)的溶液逐滴加入到40℃水浴、不断搅拌的步骤(4)溶液中，搅拌2h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化24h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球2：15％微生物-0％cldh-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为47.1％、59.7％和60.9％，对四环素的去除率分别为24.2％、29.7％和43.5％。

实施例3：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)选取牛的粪便进行微生物的培养驯化。具体步骤是将粪便加入到密封的产气培养装置中，并加入含诺氟沙星或四环素的废水进行培养驯化，每天对上清液进行换水并添加1mg/l对应的抗生素，便于产生能抵抗该抗生素的优势菌种。定期观察气体产生情况，当产生甲烷时说明已筛选出抵抗该抗生素的微生物，继续培养至装置内系统稳定，微生物足够多时取出装置内的微生物进行固定化实验，此时装置内混合液中微生物含量为30％。

(2)将0.4gsa溶于6.7ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到均一透明的sa胶状溶液；

(3)在厌氧条件下，取13.3ml步骤(1)筛选出的微生物溶液至步骤(2)的溶液中，不断搅拌，静置脱泡，得到微生物浓度为20％，sa质量分数为2％的均一悬浊液；

(4)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(5)在厌氧条件下，采用蠕动泵将步骤(3)的溶液逐滴加入到40℃水浴、不断搅拌的步骤(4)溶液中，搅拌2h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化24h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球3：20％微生物-0％cldh-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为35.3％、47.4％和49.2％，对四环素的去除率分别为32.8％、46.3％和60.5％。

实施例4：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)将0.4gsa溶于20ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到质量体积分数为2％的sa均一透明的胶状溶液；

(2)将1.6gcldh加入到步骤(1)的胶状溶液中，不断搅拌并超声分散，静置脱泡，得到均一悬浊液；

(3)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(4)将步骤(2)的溶液通过蠕动泵逐滴加入到30℃水浴、不断搅拌的步骤(3)溶液中，持续搅拌6h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化48h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球4：0％微生物-8％cldh-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为66.7％、84.9％和91.7％，对四环素的去除率分别为74.3％、92.6％和100％。

实施例5：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)选取牛的粪便进行微生物的培养驯化。具体步骤是将粪便加入到密封的产气培养装置中，并加入含诺氟沙星或四环素的废水进行培养驯化，每天对上清液进行换水并添加1mg/l对应的抗生素，便于产生能抵抗该抗生素的优势菌种。定期观察气体产生情况，当产生甲烷时说明已筛选出抵抗该抗生素的微生物，继续培养至装置内系统稳定，微生物足够多时取出装置内的微生物进行固定化实验，此时装置内混合液中微生物含量为30％。

(2)将0.4gsa溶于10ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到均一透明的sa胶状溶液；

(3)在厌氧条件下，取10ml步骤(1)筛选出的微生物溶液和1.6gcldh至步骤(2)的溶液中，不断搅拌，静置脱泡，得到微生物浓度为15％，cldh质量分数为8％，sa质量分数为2％的均一悬浊液；

(4)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(5)在厌氧条件下，采用蠕动泵将步骤(3)的溶液逐滴加入到40℃水浴、不断搅拌的步骤(4)溶液中，搅拌2h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化24h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球5：15％微生物-8％cldh-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为61.2％、79.3％和85.8％，对四环素的去除率分别为71.9％、89.5％和97.8％。

实施例6：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)选取牛的粪便进行微生物的培养驯化。具体步骤是将粪便加入到密封的产气培养装置中，并加入含诺氟沙星或四环素的废水进行培养驯化，每天对上清液进行换水并添加1mg/l对应的抗生素，便于产生能抵抗该抗生素的优势菌种。定期观察气体产生情况，当产生甲烷时说明已筛选出抵抗该抗生素的微生物，继续培养至装置内系统稳定，微生物足够多时取出装置内的微生物进行固定化实验，此时装置内混合液中微生物含量为30％。

(2)将0.4gsa溶于10ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到均一透明的sa胶状溶液；

(3)在厌氧条件下，取10ml步骤(1)筛选出的微生物溶液和1.6g麦饭石至步骤(2)的溶液中，不断搅拌，静置脱泡，得到微生物浓度为15％，麦饭石质量分数为8％，sa质量分数为2％的均一悬浊液；

(4)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(5)在厌氧条件下，采用蠕动泵将步骤(3)的溶液逐滴加入到40℃水浴、不断搅拌的步骤(4)溶液中，搅拌2h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化24h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球5：15％微生物-8％麦饭石-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为60.1％、76.3％和81.4％，对四环素的去除率分别为61.3％、77.6％和84.8％。

实施例7：一种微生物固定化凝胶球的制备方法

(1)选取牛的粪便进行微生物的培养驯化。具体步骤是将粪便加入到密封的产气培养装置中，并加入含诺氟沙星或四环素的废水进行培养驯化，每天对上清液进行换水并添加1mg/l对应的抗生素，便于产生能抵抗该抗生素的优势菌种。定期观察气体产生情况，当产生甲烷时说明已筛选出抵抗该抗生素的微生物，继续培养至装置内系统稳定，微生物足够多时取出装置内的微生物进行固定化实验，此时装置内混合液中微生物含量为30％。

(2)将0.4gsa溶于10ml去离子水中，不断搅拌并超声分散，得到均一透明的sa胶状溶液；

(3)在厌氧条件下，取10ml步骤(1)筛选出的微生物溶液和1.12gcldh、0.48g麦饭石至步骤(2)的溶液中，不断搅拌，静置脱泡，得到微生物浓度为15％，cldh质量分数为8％，sa质量分数为2％的均一悬浊液；

(4)将1gcacl2溶于50ml去离子水中得到质量体积分数为2％的cacl2均一透明溶液；

(5)在厌氧条件下，采用蠕动泵将步骤(3)的溶液逐滴加入到40℃水浴、不断搅拌的步骤(4)溶液中，搅拌2h，待反应完全后，在室温状态下搅拌固化24h，取出凝胶球，用去离子水洗去多余的ca²⁺，即得到微生物固定化凝胶球5：15％微生物-8％cldh-sa凝胶球。

室温下，20个微生物固定化凝胶球在4h、24h和48h时对10mg/l的诺氟沙星的去除率分别为64.5％、78.8％和87.8％，对四环素的去除率分别为65.2％、79.5％和88.6％。

结论分析：

1)通过实施例2、3的比较可知，微生物的添加量为15％时，吸附效果最好，这说明降解抗生素的微生物量也有个适宜的浓度，超过这一浓度，反而会影响微生物的吸附效果。

2)通过实施例4、5的比较可知，“cldh-sa凝胶球”较“微生物-cldh-sa凝胶球”具有更好地吸附效果，这说明：cldh本身对抗生素的吸附效果就很好，加了微生物会有所降低。

3)通过实施例6、7的比较可知，添加适量的麦饭石可以进一步提高“微生物-cldh-sa凝胶球”对抗生素的吸附效果。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。