一种纳豆激酶液态发酵方法与流程

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种纳豆激酶生产方法。

背景技术

1987年，日本sumi博士于纳豆中发现了一种能有效溶解心脏和大脑中血栓的酶—纳豆激酶（nattokinase，nk），从此开始了对nk的应用与研究。纳豆激酶由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于uk、sk、tpa的蛋白质，是由纳豆在发酵过程中产生的丝氨酸蛋白酶，可将纤维蛋白水解成小肽和氨基酸，并具有良好的溶栓能力，且在降血压，预防心脑血管疾病等方面也具有一定疗效。目前医学上批准应用的溶栓药物有：链激酶（streptokinase，sk）和尿激酶（urkinase，uk）等，但它们均在一定程度上有某种缺陷，如药效时间短、易出血等。与现有的溶栓类药物相比，纳豆激酶源自传统食品，不仅价格低廉，安全性高，且纳豆激酶体内半衰期长，可被肠道吸收，不易引起出血，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tpa，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性，因此受到了生物医学和食品界的广泛关注。近年来，国内市场上纳豆激酶胶囊种类繁多，但纳豆激酶的溶纤度和活性却相对较低。

目前纳豆激酶主要有固态发酵和液态发酵两种方法。固态发酵是较为传统的发酵方法，产量低劳动强度大，液态发酵虽然提高了纳豆激酶的产量，但仍然不能满足需求。提高纳豆激酶产量主要方法有:（1）通过诱变，筛选，挑选高产纳豆激酶菌株；（2）优化发酵培养基及发酵条件；（3）运用基因工程技术获得高产酶工程菌。发酵获得纳豆激酶通过离心去除菌体，盐析除去杂蛋白，透析和超滤、凝胶柱等方法除盐来纯化酶液。

纳豆激酶干燥方法主要有真空冷冻干燥和喷雾干燥等方法，真空冷冻干燥的纳豆激酶活力高，此外适宜的保护剂的添加也能更好的保持纳豆激酶活力，同时又能保证纳豆菌较高的存活率。

豆渣是豆制品工业的主要副产物，目前国内大豆食品行业每年可产生几千万吨的湿豆渣，豆渣含有较多的多糖，膳食纤维，异黄酮，蛋白质等营养物质，是一种健康绿色的新型保健食品原材料。具有降低血压，减少脑血管疾病，改善糖尿病患者胰岛素水平。尽管营养作用被人们熟知，但豆渣含水量极高，黏度极大容易腐败，易污染环境，处理难度大。近年应用较多的豆渣加工方法有发酵处理法，螺杆挤压法，粉碎处理法等。但由于豆渣中膳食纤维化学结构中含有大量的亲水基团具有很高的结合水含量，在螺杆挤压法，粉碎处理法过程中需要耗费大量能量，毫无经济效益而言。而利用发酵法来处理豆渣生产一种产品如纳豆激酶，能够简化工艺，节约能源，降低生产成本，带来巨大的经济和社会效益。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种纳豆激酶生产方法。

1、一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80~90%，灭菌；

2）按3~10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；

3）36~38℃摇床培养30~40小时；4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液；

4）干燥；

步骤2）所述的接种量为8%；

步骤2）所述的活化为：将纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释成10^-3~10^-6梯度，平板划线于含有2%琼脂的lb培养基上培养18h，然后挑取单菌落接入lb液体培养基中，活化三代，然后按3%接种量接于lb液体培养基中120rpm，37℃培养12h；菌液在高速冷冻离心机中，4℃、9500r/min离心10min；将离心后的菌体用无菌水洗涤两次，重悬，使菌悬液浓度调整至10⁷cfu/ml；

步骤1）所述的灭菌为121℃温度下灭菌20min；

步骤3）所述的摇床培养在37℃温度下，培养36h；

步骤4）所述的过滤为0.45～0.22µm的微孔滤膜过滤；

步骤4）所述的纯化为加入硫酸铵至饱和度达到50~90%，0~4℃静置10~20h，9000~10000rpm/min离心8~15min，取沉淀，用缓冲溶液复溶，透析除盐；

将透析后的纳豆激酶液，按体积比1:2~4加入海藻糖麦芽糊精混合保护剂，喷雾干燥，得纳豆激酶粉；

所述的海藻糖麦芽糊精混合保护剂为：麦芽糊精6g、海藻糖12g，加入100ml蒸馏水；

所述的体积比1:3。

本发明目的是提供一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80-90%；2）按3-10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；3）36~38℃摇床培养30~40小时；4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液；所得的粗酶液加入硫酸铵至饱和度达到50~90%，0~4℃静置10~20h，9000~10000rpm/min离心8~15min，取沉淀，用缓冲溶液复溶，透析除盐，得到纳豆激酶；再与海藻糖麦芽糊精保护剂混合，喷雾干燥，得到纳豆激酶酶粉；本发明制备的纳豆激酶的比酶活可达到385.14iu/mg，稳定性良好。

附图说明

图1纳豆芽孢杆菌显微镜形态；

图2发酵单因素试验结果；

图3不同培养基活菌数结果；

图4不同培养基产纳豆激酶活性结果；

图5盐析结果图；

图6不同保护剂下冷冻干燥后纳豆激酶稳定性的比较结果；（a）海藻糖保护剂，（b）麦芽糊精保护剂，（c）乳清蛋白粉保护剂，（d）混合保护剂ⅰ，（e）混合保护剂ⅱ；

图7不同保护剂下喷雾干燥后纳豆激酶稳定性的比较结果；（a）海藻糖保护剂，（b）麦芽糊精保护剂，（c）乳清蛋白粉保护剂，（d）混合保护剂ⅰ，（e）混合保护剂ⅱ。

具体实施方式

实施例1纳豆激酶粗酶液的制备

1、发酵剂的制备

购买纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释成10^-3至10^-6不同梯度平板划线于含有2%琼脂的lb培养基上培养18h进行镜检如图1，然后挑取单菌落接入lb液体培养基中，活化三代，然后按3%接种量接于lb液体培养基中120rpm，37℃培养12h；菌液在高速冷冻离心机中，4℃、9500r/min离心10min；将离心后的菌体用无菌水洗涤两次，重悬，使菌悬液浓度调整至10⁷cfu/ml，作为发酵剂。

2、发酵培养基的制备

在室温下，按大豆与水质量比1:5浸泡13h，将水沥干，浸泡后的大豆与100℃的水在料理机中磨浆3min，过滤，得到新鲜豆渣，调整豆渣水分含量约为85%。将预处理后的鲜豆渣和水不同比例配置成液态发酵培养基。

3、纳豆激酶粗酶液的制备

发酵培养基放入半自动高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷却后按8%(v/w)的接种量接种10⁷cfu/ml的纳豆芽孢杆菌发酵剂，然后放入设定好转速（160rpm）和温度（37℃）的摇床中培养至所需时间，取出发酵液以9500rpm、10min离心，用0.45µm和0.22µm的微孔滤膜除菌，收集去除菌体的上清液得到的纳豆激酶粗酶液，放入4℃冰箱保存。

实施例2纳豆激酶液态发酵工艺优化

一、纳豆激酶的发酵条件优化

考察接种量、发酵温度、发酵时间、摇床转速、固液比五个因素对纳豆激酶活性的影响，得到其纳豆激酶最适酶活性的参数范围如图2，并在单因素试验基础上根据box–behnken原理对发酵时间，摇床转速，接种量三个主要因素进行响应面试验设计试验因素水平表见表1，试验结果见表2；

通过单因素试验可以确定在37℃时酶活性达到最高，这与温度对菌体的代谢影响有关，温度低时菌体代谢慢，产酶少；而随着温度升高，代谢加快消耗营养物质也随着加快，同时高温容易使酶蛋白失活；固液比虽然在1:3时达到酶活最高，但是由于固形物所占比例过大，不利于工业生产，因此在固液比1:5时较为合理；因此选择发酵时间，摇床转速，接种量三个影响较大的因素进行响应面优化。以产纳豆激酶单因素最优时间36h为发酵时间响应面中心点，考虑到工业生产的实际选择稍低一点的转速160rpm为摇床转速的响应面中心点。接种量响应面中心点选在产酶较为稳定的8%。

表1box-behnken试验因素水平表

表2box-behnken试验结果

通过design-expert8.05.b软件对表2的数据进行回归分析，可得到二次回归模型的方差分析表，其中y纳豆激酶活力对a发酵时间、b摇床转速、c接种量的二次多项式回归方程如下：y=+273.15-20.65*a+108.7*b+28.26*c-5.43*a*b+40.22*a*c+16.30*b*c-88.36*a²-47.05*b²-34.01*c²；模型的p值显著，失逆项p值不显著说明建模成立，且r²值为0.9288说明模型拟合度较好；由回归模型的显著性分析可知相对于纳豆激酶活性而言摇床转速影响极显著，其次为接种量，然后为发酵时间；最终优化结果在36h，170rpm，9%接种量时产纳豆激酶酶活最高达到318iu/ml，经过三次平行试验，预测值与实际值差异不显著。

二、纳豆激酶的测定方法

1、尿激酶标准曲线

将50000iu/g的尿激酶标品，稀释成不同酶活力梯度，建立尿激酶活力单位与纤维蛋白平板溶解圈大小间相关性，最终在50-350iu/ml呈现良好的线性关系，得到回归方程y=0.0023x+0.8214,r²=0.997。

2、纳豆激酶活性测定

酶纤溶活力的测定采用纤维蛋白平板法，以纤维蛋白溶解圈直径表示纳豆激酶的活性；用移液器精确吸取10μl的粗酶液，打入纤维蛋白平板中，放入37℃恒温培养箱中培养18h后取出测定溶解圈直径，通过与尿激酶标准曲线直径对比确定纳豆激酶酶纤溶活力。

纤维蛋白平板组分：20ml1%的琼脂糖溶液（由0.9%nacl溶液溶解），2ml牛血清纤维蛋白原（7.5mg/ml，由0.1mol/lph7.4磷酸缓冲液:0.9%nacl溶液=1:17的混合工作液溶解）,200μl凝血酶（250u/ml）。

实施例3不同发酵培养基的产酶比较及活菌计数

考察培养基的种类对纳豆激酶活力的影响，具体操作步骤如下：

将达到10⁷cfu/ml活菌数的纳豆芽孢杆菌发酵剂以相同的接种量分别接入豆渣培养基、玉米豆粕培养基、lb培养基中，并在相同温度、相同转速的摇床中培养，然后每隔12h分别取三种液体培养基离心取上清液进行纳豆激酶活力的测定，同时取部分上清液进行10倍梯度系列的稀释，选择2~3个合适梯度进行平板均匀的涂布，每个梯度进行三次平行试验并取平均值进行活菌落计数；纳豆激酶活性结果见图3，活菌数结果见图4。

由图可以看出，三种培养基的活菌数趋势大致一致均在60h达到活菌数最大，在酶活方面，lb培养基一直未出现酶活，而玉米豆粕培养基虽然酶活在总体趋势上高于豆渣培养基，但其成本要高于豆渣培养基。

所述的玉米豆粕培养基组分为玉米粉80g、豆粕40g、磷酸氢二钠8g、硫酸铵4g、氯化钙2g、氯化铵1.5g、去离子水1000ml，培养基ph7.0-7.2；lb培养基组分为牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖10g、去离子水1000ml，培养基ph7.2-7.4。

实施例4纳豆激酶的初步纯化

硫酸铵分离沉淀法对纳豆激酶进行初步纯化，取粗酶液30ml，加入硫酸铵，使其饱和度分别达到50%、60%、70%、80%和90%，于4℃冰箱静置12h，9500rpm/min离心10min，将沉淀用缓冲液复溶，分别测定上清液和沉淀中纳豆激酶酶活力和蛋白质的含量，并通过相对酶活以确定硫酸铵分级沉淀的饱和点；将硫酸铵初步纯化后的粗酶液，透析除盐。结果如图5所示，在硫酸铵饱和度50~60%纳豆激酶的相对酶活显著提高，而在70%饱和度时开始相对酶活降低，因此选择60%为盐析饱和度；分别测定发酵上清液、60%为盐析的纳豆激酶、经透析后的纳豆激酶的酶活力、蛋白浓度，结果见表3，表明经盐析透析后酶活力提高了2.23倍。

表3纳豆激酶纯化结果

实施例5纳豆激酶干燥保护剂的制备

分别制备海藻糖保护剂、混合保护剂ⅰ、混合保护剂ⅱ、麦芽糊精保护剂、乳清蛋白粉保护剂，用于后续实验，制备方法具体如下：

1、海藻糖保护剂：称取海藻糖18g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

2、混合保护剂ⅰ：分别称取麦芽糊精6g、海藻糖12g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

3、混合保护剂ⅱ：分别称取麦芽糊精6g、β-环状糊精2g、乳清蛋白粉10g加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

4、麦芽糊精保护剂：称取麦芽糊精18g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在；

5、乳清蛋白粉保护剂：称取乳清蛋白粉18g，加入100ml蒸馏水中搅拌均匀至无颗粒存在。

实施例6纳豆激酶粗酶液干燥工艺实验

一、纳豆激酶粗酶液喷雾干燥条件优化

按照纳豆激酶粗酶液与实施例5制备的各类保护剂按体积比1:3（v/v）的比例混匀，10000r/min均质2分钟后进行喷雾干燥，设定喷雾干燥机进口温度分别为140、150、160℃，出口温度75℃，蠕动泵转速分别为240、340、440ml/h，风机速度70hz，撞针时间1s，撞针间隔1s，干燥后收集酶粉进行活性测定，考察保护剂种类、喷雾干燥进口温度、喷雾干燥蠕动泵转速对纳豆激酶活性的影响。

以纳豆激酶活力为考核指标，确定各单因素合适的喷雾干燥条件，为喷雾干燥纳豆激酶的条件优化提供参考范围，试验设计的每个因素设置3个平行；研究不同喷雾干燥条件下纳豆激酶的活性，结果表明，在保护剂相同（混合保护剂ⅱ）和蠕动泵转速（340ml/h）的条件下，随着进口温度的上升，纳豆激酶部分失活，酶活力逐渐降低，在进口温度低于140℃时，收集瓶口会有少量糊状物体生成，影响喷雾干燥结果。糊状物体可能是由于喷雾干燥温度较低或蠕动泵转速较快导致干燥不完全；结果表明在相同进口温度（150℃）、同种保护剂（海藻糖保护剂）的条件下，最适蠕动泵转速为340ml/h，此时纳豆激酶活性最大；在蠕动泵转速为240ml/h时，可能由于蠕动泵转速过慢导致纳豆激酶在高温条件下逐渐失活；在蠕动泵转速为440、540ml/h时，可能由于蠕动泵转速过快，粗酶液干燥不完全，产率下降，从而导致酶活降低；结果表明，在相同进口温度（150℃）、蠕动泵转速（340ml/h）的条件下，此时纳豆激酶活性最大；重复三次试验，得纳豆激酶酶活平均值为(210200±19126)fu/g。

纳豆激酶的纤溶活力测定采用纤维蛋白平板法，以纳豆激酶溶解纤维蛋白平板所产生的溶解圈直径表示纳豆激酶的活性；纳豆激酶的活力是以其相对于尿激酶的活力单位来表示，建立尿激酶的活力线性回归方程为：y=0.0023x+0.8207，r²=0.998；

纳豆激酶的酶活力(fu/g)＝a×4，式中：a—样品测得的利用尿激酶标准曲线计算得到相应纳豆激酶酶活力单位(fu/g)；4—待测纳豆激酶样品的稀释倍数。

二、纳豆激酶稳定性的检测

通过冷冻干燥和喷雾干燥的方法，分别进行纳豆激酶的干燥，测定其酶活力；同时考察不同类型的保护剂对纳豆激酶酶活的影响；具体操作如下：

在确定相同进口温度（160℃）、蠕动泵转速（340ml/h）条件下，实施例5制备的不同保护剂保护粗酶液，进行喷雾干燥；取10ml实施例2制备的各保护剂与粗酶液混合均质后的溶液，在-20℃冰箱中预冻2h后移至-80℃冰箱冷冻12h，将冷冻后的粗酶液移至真空冷冻干燥机进行冻干；上述两种方法得到纳豆激酶粉末，分别取200mg装入1.5ml离心管中，将离心管与干燥剂放入袋中真空包装，分别在0℃、4℃、常温（约18℃）、37℃条件下保存40天，每隔十天进行一次纳豆激酶酶活的测定。

为进一步讨论不同保护剂进行干燥后所产生纳豆激酶活力的稳定性，本实验对保藏温度和保藏时间对纳豆激酶活力稳定性的影响程度进行研究；通过图6可以看出，冷冻干燥的纳豆激酶在相同保藏温度的条件下，随着时间的增长不同保护剂的纳豆激酶活性均逐渐降低；在相同保藏时间、保藏温度的条件下，以海藻糖作保护剂进行冷冻干燥所产生的纳豆激酶活性最高。

通过图7可以看出，经喷雾干燥的纳豆激酶在相同保藏温度的条件下，随着时间的增长纳豆激酶活性均逐渐降低；在相同保藏时间，相同保藏温度的条件下，以混合保护剂ⅰ进行喷雾干燥所产生的纳豆激酶活性最高；在相同保藏时间、不同保藏温度的条件下，相同保护剂进行喷雾干燥产生的纳豆激酶活性无显著变化；综上所述，保藏温度对不同保护剂喷雾干燥产生的纳豆激酶活性均无较大影响，这可能与纳豆激酶在45℃以下和ph=7～9范围内酶活相对稳定有关；但是随保藏时间的增长，经不同保护剂喷雾干燥产生的纳豆激酶活性均逐渐降低与冷冻干燥的纳豆激酶活性呈相同趋势；因此以混合保护剂ⅰ为保护剂进行喷雾干燥后的纳豆激酶储存时间长，且较为稳定，大大提高了纳豆激酶的利用价值。